植物におけるエピジェネティクス関連酵素のスクリーニング法の確立

植物表观遗传学相关酶筛选方法的建立

• 批准号: 22KJ0120
• 负责人: 沖宗 慶一
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0120/
• 关键词: ヌクレオソーム; クロマチン; エピジェネティクス; コムギ胚芽無細胞タンパク質合成

染色体を構成するDNA-ヒストンタンパク質複合体：ヌクレオソーム及びクロマチンを試験管内で再構築する当研究室独自の手法を、新たにモデル植物であるシロイヌナズナについて適用すること、さらに再構築ヌクレオソーム・クロマチンを基質として利用し、ヒトや酵母に比べて生化学的知見の少ない植物のエピジェネティクスに関連するヒストン修飾酵素の機能解明を目的に研究を実施した。試験管内ヌクレオソーム・クロマチン再構築法については、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法をベースにDNA存在下でシロイヌナズナヒストンH2A、H2B、H3、H4をコードするmRNAを共翻訳することで、ヌクレオソーム及びクロマチンの形成が確認された。環状DNA、ヌクレオソームポジショニング配列を含む直鎖DNAなど長さや塩基配列、形状の異なるDNAに対してヌクレオソームが形成されることを確認した。さらにH2AXやH3.3など5種のヒストンバリアントを含むヌクレオソーム再構築反応を実施したところ、数種類について本手法による再構築能が認められ、今後論文投稿を予定している。ヌクレオソームの高純度精製法を模索した結果、マグネシウム沈殿とスクロース密度勾配遠心分離を組み合わせることで本ヌクレオソーム再構築法に対する精製法を確立した。精製ヌクレオソームに対し、蛍光色素を用いた熱安定性の測定を実施したところ既存の報告とのおおよその一致が確認された。ヒストン修飾酵素の生化学的機能解析については、シロイヌナズナに先立ち当研究室で既に再構築反応が確立したヒトヌクレオソームを基質に実施した。ヒストン修飾反応後、Arg-Cによるゲル内消化を経てプロテオミクス解析を行なったが、目的のヒストンN末端領域のペプチド検出が認められなかったため、Arg-C消化等について条件検討が必要である。以上の研究成果をもとに分子生物学会年会にてポスター発表を実施した。

进行了这项研究是为了应用我们实验室在体外重建核小体和染色质的独特方法，用于新的模型植物拟南芥，并阐明了比人类和酵母更少的生物化学知识与植物相关的植物中与植物相关的组蛋白改性酶的功能，而不是人类和酵母菌的功能。关于体外核小体染色质重建方法，通过基于麦芽生殖细胞蛋白质合成方法的DNA，在存在DNA的情况下，编码拟南芥H2B，H3和H4的mRNA的共译证实了核小体和染色质的形成。已经证实，核小体是针对不同长度，碱基序列和形状的DNA形成的，例如圆形DNA和含有核小体定位序列的线性DNA。此外，当含有五个组蛋白变异的核小体重建反应（例如H2AX和H3.3）时，将几种类型的核小体识别为使用这种方法具有重建能力，并计划在将来提交论文。由于探索了核小体高纯度纯化方法，通过将镁沉淀和蔗糖密度梯度离心型结合来建立核小体重建方法的纯化方法。使用荧光染料对纯化的核小体进行了热稳定性测量，并确认与现有报告的近似一致。为了对组织改性的酶进行生化分析，已经在我们的实验室中建立的人核小体被用作拟南芥之前的底物。在组蛋白修饰反应后，通过使用ARG-C进行内部消化进行蛋白质组学分析，但是未观察到靶组蛋白N末端区域中的肽检测，因此需要ARG-C消化的条件等。基于上述研究结果，在分子生物学学会年会上举行了海报介绍。

项目成果

植物クロマチンの試験管内再構築法

植物染色质体外重建方法

• 发表时间: 2022

コムギ胚芽共翻訳ヌクレオソーム再構築法を利用したエピジェネティクス関連酵素のスクリーニング法確立

小麦胚芽共翻译核小体重建法筛选表观遗传学相关酶方法的建立

• 发表时间: 2022
• 作者: 沖宗慶一;Petra Banko;高須賀太一
• 通讯作者: 高須賀太一