植物におけるエピジェネティクス関連酵素のスクリーニング法の確立

植物表观遗传学相关酶筛选方法的建立

• 批准号: 22KJ0120
• 负责人: 沖宗 慶一
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0120/
• 关键词: ヌクレオソーム; クロマチン; エピジェネティクス; コムギ胚芽無細胞タンパク質合成

染色体を構成するDNA-ヒストンタンパク質複合体：ヌクレオソーム及びクロマチンを試験管内で再構築する当研究室独自の手法を、新たにモデル植物であるシロイヌナズナについて適用すること、さらに再構築ヌクレオソーム・クロマチンを基質として利用し、ヒトや酵母に比べて生化学的知見の少ない植物のエピジェネティクスに関連するヒストン修飾酵素の機能解明を目的に研究を実施した。試験管内ヌクレオソーム・クロマチン再構築法については、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法をベースにDNA存在下でシロイヌナズナヒストンH2A、H2B、H3、H4をコードするmRNAを共翻訳することで、ヌクレオソーム及びクロマチンの形成が確認された。環状DNA、ヌクレオソームポジショニング配列を含む直鎖DNAなど長さや塩基配列、形状の異なるDNAに対してヌクレオソームが形成されることを確認した。さらにH2AXやH3.3など5種のヒストンバリアントを含むヌクレオソーム再構築反応を実施したところ、数種類について本手法による再構築能が認められ、今後論文投稿を予定している。ヌクレオソームの高純度精製法を模索した結果、マグネシウム沈殿とスクロース密度勾配遠心分離を組み合わせることで本ヌクレオソーム再構築法に対する精製法を確立した。精製ヌクレオソームに対し、蛍光色素を用いた熱安定性の測定を実施したところ既存の報告とのおおよその一致が確認された。ヒストン修飾酵素の生化学的機能解析については、シロイヌナズナに先立ち当研究室で既に再構築反応が確立したヒトヌクレオソームを基質に実施した。ヒストン修飾反応後、Arg-Cによるゲル内消化を経てプロテオミクス解析を行なったが、目的のヒストンN末端領域のペプチド検出が認められなかったため、Arg-C消化等について条件検討が必要である。以上の研究成果をもとに分子生物学会年会にてポスター発表を実施した。

组成染色体的DNA-组蛋白复合物：我们实验室独特的体外重建核小体和染色质的方法将应用于新的模式植物拟南芥，我们还将使用重建的核小体和染色质作为底物，利用这种方法，我们进行研究的目的是阐明与植物表观遗传学相关的组蛋白修饰酶的功能，与人类和酵母相比，植物表观遗传学的生化知识较少。体外核小体/染色质重建方法基于小麦胚芽无细胞蛋白质合成方法，涉及编码拟南芥组蛋白H2A、H2B、H3和H4的mRNA在DNA存在下共翻译以形成核小体和染色质。确认的。我们证实核小体是在不同长度、碱基序列和形状的DNA上形成的，例如含有核小体定位序列的环状DNA和线性DNA。此外，当我们进行涉及H2AX和H3.3等五种组蛋白变体的核小体重组反应时，我们发现该方法具有重组多种类型的能力，我们计划将来提交一篇论文。为了寻找高纯度的核小体纯化方法，我们建立了一种结合镁沉淀和蔗糖密度梯度离心的核小体重建方法的纯化方法。当我们使用荧光染料测量纯化核小体的热稳定性时，我们证实结果与现有报道大致一致。关于组蛋白修饰酶的生化功能分析，我们使用人核小体作为底物，我们实验室在使用拟南芥之前已经建立了重组反应。组蛋白修饰反应后，用Arg-C进行凝胶内消化后进行蛋白质组分析，但组蛋白N端区域未检测到目标肽，因此需要考虑Arg-C消化的条件， ETC。基于以上研究成果，我们在分子生物学会年会上做了海报展示。

项目成果

植物クロマチンの試験管内再構築法

植物染色质体外重建方法

• 发表时间: 2022

コムギ胚芽共翻訳ヌクレオソーム再構築法を利用したエピジェネティクス関連酵素のスクリーニング法確立

小麦胚芽共翻译核小体重建法筛选表观遗传学相关酶方法的建立

• 发表时间: 2022
• 作者: 沖宗慶一;Petra Banko;高須賀太一
• 通讯作者: 高須賀太一