放射性同位元素標識プラスミドを用いた低線量内部被ばく影響の数値化

使用放射性同位素标记的质粒量化低剂量内照射效应

• 批准号: 22K19852
• 负责人: 廣井 朋子
• 金额: $ 3.99万
• 依托单位: St. Marianna University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19852/
• 关键词: リアルタイムRT-PCR; DNAトランスフェクション; ハウスキーピング遺伝子; 内部被ばく; 放射線影響; リアルタイムPCR

ヒト色素性乾皮症皮膚線維芽細胞HTZ17XP（ATCC CRL-1360、以下XP）またはヒト正常皮膚線維芽細胞NHDF（PromoCell C-12300、以下ND）を培養し、RNAを抽出してリアルタイムRT-PCRを行い、安定的に発現しているハウスキーピング遺伝子を検出するためのプライマーセット15種類の中から、細胞種の違いや培養時間の違い、プラスミドDNAのトランスフェクションの有無による影響をあまり受けず変動の少ないものを選別した。プラスミドDNAにレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を挿入したもの（pCMV-script-Luc）を使用して、XPおよび NDへの導入効率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。放射性同位元素で標識されたDNAを添加してからトランスフェクションまでの手順をできるだけ少なくすることによって、添加したＲＩの損失が少なく、なおかつ核へのDNA導入効率が良い実験系を構築することを目的とした。その方法として、(1)セルフライゲーションの過程を除いて、直鎖状DNAのままトランスフェクションをする、(2)導入される培養細胞を、前培養されてプレートへ接着した状態ではなく、浮遊したままの状態でトランスフェクションを行う、など、様々な方法を試みた。ＲＩ標識反応として、PCR時にＲＩを添加するのではなく、すでに増幅の済んだPCR産物を基質として、従来からあるランダムプライマー標識法により標識する方法を検討した。32P-dCTPを用いて、精製カラムによる未反応ＲＩの除去・トランスフェクション・RNA抽出・リアルタイムRT-PCRの各行程において、反応チューブやカラムのそれぞれを測定し、どのようにＲＩが分配されていくかを検討した。

人色素性干皮病皮肤成纤维细胞HTZ17XP(ATCC CRL-1360，以下简称XP)或人正常皮肤成纤维细胞NHDF(PromoCell C-12300（以下简称ND），提取RNA，进行实时RT-PCR，并根据细胞类型从15个引物组中选择稳定表达的管家基因。变异，并且不受培养物、培养时间或是否存在质粒 DNA 转染的差异的影响。使用插入了荧光素酶基因作为报告基因的质粒DNA(pCMV-script-Luc)，通过荧光素酶测定来测定导入XP和ND的效率。目的是最大限度地减少从添加放射性同位素标记的 DNA 到转染的步骤数量，从而创建一个添加 RI 损失较少且 DNA 引入细胞核效率较高的实验系统。这些方法包括（1）按原样转染线性DNA，排除自连接过程，以及（2）以悬浮状态转染培养细胞，而不是在预培养状态下并附着到平板上。我们尝试了各种方法。 ，包括在完整状态下进行转染。对于RI标记反应，我们研究了一种使用常规随机引物标记方法、使用已经扩增的PCR产物作为底物的标记方法，而不是在PCR过程中添加RI。使用 32P-dCTP，在使用纯化柱去除未反应的 RI、转染、RNA 提取和实时 RT-PCR 的每个步骤中测量每个反应管和柱，并考虑 RI 是否分布。