放射性同位元素標識プラスミドを用いた低線量内部被ばく影響の数値化

使用放射性同位素标记的质粒量化低剂量内照射效应

• 批准号: 22K19852
• 负责人: 廣井 朋子
• 金额: $ 3.99万
• 依托单位: St. Marianna University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19852/
• 关键词: リアルタイムRT-PCR; DNAトランスフェクション; ハウスキーピング遺伝子; 内部被ばく; 放射線影響; リアルタイムPCR

ヒト色素性乾皮症皮膚線維芽細胞HTZ17XP（ATCC CRL-1360、以下XP）またはヒト正常皮膚線維芽細胞NHDF（PromoCell C-12300、以下ND）を培養し、RNAを抽出してリアルタイムRT-PCRを行い、安定的に発現しているハウスキーピング遺伝子を検出するためのプライマーセット15種類の中から、細胞種の違いや培養時間の違い、プラスミドDNAのトランスフェクションの有無による影響をあまり受けず変動の少ないものを選別した。プラスミドDNAにレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を挿入したもの（pCMV-script-Luc）を使用して、XPおよび NDへの導入効率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。放射性同位元素で標識されたDNAを添加してからトランスフェクションまでの手順をできるだけ少なくすることによって、添加したＲＩの損失が少なく、なおかつ核へのDNA導入効率が良い実験系を構築することを目的とした。その方法として、(1)セルフライゲーションの過程を除いて、直鎖状DNAのままトランスフェクションをする、(2)導入される培養細胞を、前培養されてプレートへ接着した状態ではなく、浮遊したままの状態でトランスフェクションを行う、など、様々な方法を試みた。ＲＩ標識反応として、PCR時にＲＩを添加するのではなく、すでに増幅の済んだPCR産物を基質として、従来からあるランダムプライマー標識法により標識する方法を検討した。32P-dCTPを用いて、精製カラムによる未反応ＲＩの除去・トランスフェクション・RNA抽出・リアルタイムRT-PCRの各行程において、反応チューブやカラムのそれぞれを測定し、どのようにＲＩが分配されていくかを検討した。

Human xeroderma pigmentosum skin fibroblasts HTZ17XP (ATCC CRL-1360, hereinafter XP) or human normal skin fibroblast NHDF (PromoCell C-12300, hereinafter ND) were cultured, RNA was extracted and real-time RT-PCR was performed, and from 15 primers sets for detecting stablely expressed housekeeping genes, those with little variation选择了细胞类型差异，培养时间差异或存在或不存在质粒DNA转染的影响很小。通过使用质粒DNA插入作为报告基因（PCMV-Script-Luc），通过荧光素酶测定确定转移到XP和ND的效率。目的是构建一个实验系统，该系统通过添加放射性同位素标记为尽可能多的放射性同位素标记来降低添加RI的损失，并具有很高的效率。已经尝试了各种方法，包括（1）在自我结合过程的情况下转染线性DNA，以及（2）以悬浮状态转染引入的培养细胞，而不是预培养并粘附在板上。作为RI标记反应，使用了一种使用常规的随机引物标记方法标记的方法，而不是在PCR期间添加RI，其中已被放大的PCR产物被用作底物。使用32P-DCTP，使用纯化柱，转染，RNA提取和实时RT-PCR在每个中删除未反应RI的情况下测量每个反应管和柱，以及如何检查RI分布。