翻訳異常を解消するリボソーム品質管理機構の個体内イメージング

核糖体质量控制机制的个体成像以解决翻译异常

基本信息

批准号：
22K19300
负责人：
三嶋雄一郎
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19300/
关键词：
ゼブラフィッシュリボソームイメージング

项目摘要

mRNAがタンパク質へと翻訳される際に翻訳装置であるリボソームが衝突すると、特殊なリボソーム二量体構であるDisomeが生じる。このDisome は、リボソーム品質管理機構であるRQCとNGDにより解消される。しかしリボソーム品質管理機構がいつどこでどの程度起こっているのかをリアルタイムで検出する方法はまだ存在しない。本研究では、RQCとNGDを生体内で可視化する実験系を小型熱帯魚であるゼブラフィッシュの胚内で構築し、リボソームの衝突と品質管理の時空間的な分布を、個体発生過程において解明することに挑戦する。本年度は、disome上で複合体を形成することが報告されているZnf598-GIGYF2-4EHP複合体に着目し、これらの相互作用がゼブラフィッシュでも生じているかの検証を行った。その結果、試験管内翻訳によって調整したゼブラフィッシュZnf598-GIGYF2-4EHPの3者の間での結合を、免疫沈降により確認することができた。NGDをGFPレポーターを用いて可視化できるか検討するために、我々が同定したNGDの標的となる内在mRNA配列の検討を行い、リボソームの衝突とNGDを引き起こすことができる最小の配列要素を決定した。さらにその配列のアミノ酸置換変異体を作成し、NGD誘導活性を失わせることができる変異を複数同定した。一方で、NGD誘導活性を増強する変異を見つけることはできなかった。

当mRNA翻译成蛋白质时，当翻译机器核糖体发生碰撞时，就会产生一种特殊的核糖体二聚体结构——Disome。这种 dissome 通过核糖体质量控制机制 RQC 和 NGD 来解决。然而，仍然没有办法实时检测核糖体质量控制机制发生的时间、地点和程度。在这项研究中，我们构建了一个实验系统来可视化斑马鱼（一种小型热带鱼）胚胎中的 RQC 和 NGD，并阐明了个体发育过程中核糖体碰撞的时空分布和质量控制。今年，我们重点研究了 Znf598-GIGYF2-4EHP 复合体，据报道该复合体在二体上形成复合体，并验证了这些相互作用是否也发生在斑马鱼中。结果，体外翻译制备的三种斑马鱼Znf598-GIGYF2-4EHP之间的结合可以通过免疫沉淀得到证实。为了研究 NGD 是否可以使用 GFP 报告基因可视化，我们检查了我们确定为 NGD 目标的内源 mRNA 序列，并确定了可以触发核糖体碰撞和 NGD 的最小序列元件。此外，我们创建了该序列的氨基酸取代突变体，并鉴定了多个可以消除 NGD 诱导活性的突变。另一方面，我们无法找到任何增强 NGD 诱导活性的突变。