ラジカル架橋酵素により構築した生理活性環状化ペプチドの作用機構解析と最適化

自由基交联酶构建生物活性环化肽的机理分析与优化

基本信息

批准号：
22K19150
负责人：
岡島俊英
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

酵素の翻訳後修飾に関わるラジカル架橋酵素QhpDは、タンパク質に分子内チオエーテル架橋を形成し、ループ型環状構造を多重に作り出すことができる。本研究は、このQhpDを利用することによって、酵素的なペプチド環状化手法を開発し、新規な機能性を持つ環状ペプチドを作り出すことを目的とする。すなわち、新しい中分子創薬のフレームワークとして重要な意義がある。まず、アラニン残基を連続したAla環状化ペプチドの動物細胞に対する作用の解析、あるいは物理化学的な解析を行うために、(Ala)4, (Ala)5, (Ala)6ペプチドの調製を行なった。特にNMRによる2価金属イオンとの相互作用解析に多量の試料が必要とされることが判明しており、本年度においてその調製に注力した。概ね次年度より本格的な解析を開始できるものと考えている。さらに、架橋酵素QhpDの発現を制御し、架橋ペプチドの環状化をon/offできる共発現系の構築を試みた。当初計画では、QhpDの発現制御を、大腸菌コールドショック遺伝子cspAのプロモーター配列（pColdベクター使用）で行うことを計画していたが、pColdベクターの誘導条件である15 ℃では、T7プロモーター支配下の架橋ペプチドの発現が停止し、共発現系が想定通りに機能しなかった。そこで、QhpDの発現制御を、pBADプラスミド上でアラビノースプロモーター支配下で行うようにした。その結果、IPTG誘導下架橋ペプチドを発現下させているところに、アラビノースの有無によって、架橋酵素の発現をon/offできることがわかった。本系を用いることで、新規抗菌性ペプチドの探索に向けた基盤を確立することができた。

与酶的翻译后修饰有关的自由基交联酶QHPD可以在蛋白质中形成分子内硫醚交联，从而形成多个环形型环结构。这项研究旨在通过利用该QHPD创建新型功能性环状肽来开发酶促肽环化技术。换句话说，它作为中分子药物发现的新框架具有重要意义。首先，（ALA）4，（ALA）5，（ALA）6肽准备分析具有连续的丙氨酸残基对动物细胞或进行物理化学分析的ALA周期化肽的影响。已经发现，NMR相互作用分析需要大量样本，我们专注于今年的准备。我们认为，我们通常可以从明年开始全面分析。此外，我们尝试构建一个共表达系统，该系统调节交联酶QHPD的表达，并可以打开/关闭交联肽的环化。在最初的计划中，计划使用大肠杆菌冷休克基因CSPA的启动子序列（使用PCOLD载体）来控制QHPD的表达，但是在15°C下，这是PCOLD载体的感应条件，T7启动子控制下的交联肽的表达不再停止，并没有停止COEDECPRASTED系统，并且预期的是功能。因此，在阿拉伯糖启动子的控制下，在PBAD质粒上对QHPD的表达控制进行了控制。结果，发现当表达IPTG诱导的亚互动肽时，可以根据或不存在阿拉伯糖的表达来打开/关闭。使用该系统，我们能够为寻找新型抗菌肽建立基础。