ヒト嗅覚受容体セルアレイセンサーによるヒトにおい認識システムの解明

使用人类嗅觉受体细胞阵列传感器阐明人类气味识别系统

基本信息

批准号：
22K18343
负责人：
黒田俊一
金额：
$ 16.64万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

1)ヒト嗅覚受容体発現系の改良：今までにヒト嗅覚受容体発現で多くのシャペロンなどが検討されたが、依然として感度不足は解決されていない。今年度は、嗅覚受容体の正しい膜局在を促すシグナルペプチドを最適化した。頻用されているRhodopsinシグナルペプチドを、Lucy、リゾチーム、IL2由来ペプチド等への置換や融合を検討した。評価は嗅覚受容体応答で評価した。その結果、特定のシグナルペプチドが全ての嗅覚受容体の細胞表層発現および匂い分子応答を改善するものではないことが判明した。嗅覚受容体内部の構造に迫るアプローチが必要と推定された。２）Caイオン検出系の改良：今まではGCaMP6sを用いてきたが、検出可能な細胞内Caイオン濃度は100nM前後である。OR応答による細胞内Caイオン上昇が予想より低い可能性があるので、さらに高感度（10nM前後）なCameleonやYC2.60（GFP/RFP,やCFP/YFP融合体によるFRET検出）を検討した。その結果、低いCaイオン濃度域で作動する蛍光タンパク質を使用してもSN比が悪化することが多く、細胞内Caイオン濃度変化での検出は限界があると考えられた。３）各種阻害剤の検討：本センサーによるOR応答の定量は細胞内Ca濃度によるため、同濃度を最大化する阻害剤も同時に検討した。具体的な標的分子は、ORをリン酸化して脱感作するGRK3、cAMPを分解するPDE、Caイオン排出を行うNCX,PMCA、増加したCaイオンに応答して各種シグナル分子を抑制するCALM（カルモジュリン）とCAMKII（同依存性キナーゼ）とし、各阻害剤を単独もしくは組み合わせて検討した。その結果、PDEを阻害するIBMX、PMCAを阻害するカロキシンにシグナル増強効果が認められた。なお、GRK3阻害剤の検討は終了していない。

1）人类嗅觉受体表达系统的改进：尽管已经研究了许多伴侣分子的人类嗅觉受体表达，但敏感性的缺乏仍未解决。今年，我们优化了一种信号肽，可促进嗅觉受体正确的膜定位。我们研究了常用的视紫红质信号肽与Lucy、溶菌酶、IL2衍生肽等的取代或融合。评估基于嗅觉受体反应。结果表明，特定的信号肽并不能改善所有嗅觉受体的细胞表面表达和气味分子反应。假设需要一种接近嗅觉受体内部结构的方法。 2）Ca离子检测系统的改进：到目前为止，一直使用GCaMP6s，但可检测的细胞内Ca离子浓度在100 nM左右。由于 OR 响应导致的细胞内 Ca 离子增加可能低于预期，因此我们考虑了 Chameleon 和 YC2.60（使用 GFP/RFP 或 CFP/YFP 融合的 FRET 检测），它们具有更高的灵敏度（约 10 nM）。结果，即使使用在低Ca离子浓度范围内工作的荧光蛋白，信噪比也经常恶化，并且认为基于细胞内Ca离子浓度变化的检测存在极限。 3）各种抑制剂的检查：由于该传感器对 OR 响应的定量取决于细胞内 Ca 浓度，因此我们还检查了最大化相同浓度的抑制剂。具体靶分子包括GRK3（使OR磷酸化和脱敏）、PDE（降解cAMP）、NCX和PMCA（分泌Ca离子）以及CALM（响应钙调素增加而抑制各种信号分子）和CAMKII（共依赖性激酶）。，并且对每种抑制剂进行单独或组合研究。结果发现，抑制 PDE 的 IBMX 和抑制 PMCA 的 caloxin 具有信号增强作用。此外，GRK3抑制剂的研究尚未完成。