ヘプシジン関連創薬のためのＥＰＩＣシステムを応用した活性型ヘプシジン測定系の開発

使用 EPIC 系统开发活性铁调素测量系统，用于铁调素相关药物发现

• 批准号: 26461394
• 负责人: 佐々木 勝則
• 金额: $ 3.16万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26461394/
• 关键词: ヘプシジン; フェロポルチン; 鉄; Ｃell-based bioassay; Flow cytometry法; ＨＴＳ; ＤＭＲ; ＥＰＩＣ; EPIC; ラベルフリー; cell-based bioassay

ヘプシジン（Hpc）は細胞膜表面のフェロポルチン（Fpn）に作用し小腸や網内系細胞からの鉄の供給を負に制御する。Hpc産生低下は鉄過剰状態を引き起こし、一方、Hpc過剰産生は鉄欠乏状態を招く。このようなHpcに起因する病態に対する治療戦略として、Hpc agonists/antagonistsの開発が注目されている。そこで、Hpc活性測定システムとして、Fpn-GFPを安定発現した細胞株を用いたcell-based bioassayを構築し、その有効性の検証を目的とした。はじめに、クローニングしたFpn-GFP発現細胞株[A-3]のHpc isoforms; hep-20、hep-22、hep-25に対する反応性を、Flow cytometry法で評価した。結果、hpc-25を添加、培養したアッセイ系のみがhpc-25濃度依存的に蛍光減弱を示した。すなわち、今回樹立したFpn-GFP発現細胞株がcell-based bioassayとして利用可能な細胞であることを確認することができた。次に、High-throughput screeningシステムとして、細胞を刺激すると、細胞内シグナル伝達に伴う細胞骨格の変化や細胞内分子のトランスロケーションが引き起こされる動的な質量の再分布；Dynamic mass redistribution（DMR）を捉えることを可能としたEpicシステムの適応性を検討した。予め96ウェル・ラベルフリー測定用マイクロプレートに播種したA-3細胞株にHpc isoformsをそれぞれ添加し、リアルタイムでDMRをモニタリングしたところ、hpc-25を添加した系のみが動的な質量の再分布・変化を示した。このように、試料中のhpc-25濃度を生物活性として直接定量することが可能なシステムを構築することができた。

铁调素 (Hpc) 作用于细胞膜表面的铁转运蛋白 (Fpn)，负向调节小肠和网状内皮细胞的铁供应。 HPC 产量减少会导致铁过载状态，而 HPC 产量过多会导致铁缺乏状态。 Hpc激动剂/拮抗剂的开发作为Hpc引起的此类病理状况的治疗策略引起了人们的关注。因此，我们利用稳定表达Fpn-GFP的细胞系构建了基于细胞的生物测定作为Hpc活性测量系统，并旨在验证其有效性。首先，通过流式细胞术评估克隆的表达Fpn-GFP的细胞系[A-3]对Hpc亚型的反应性；hep-20、hep-22和hep-25。结果，仅添加hpc-25并培养的测定系统显示出hpc-25浓度依赖性的荧光衰减。换句话说，我们能够确认这次建立的表达Fpn-GFP的细胞系可以用作基于细胞的生物测定。接下来，作为高通量筛选系统，我们使用动态质量再分配（DMR），这是一种动态质量再分配，其中细胞的刺激引起与细胞内信号转导相关的细胞骨架的变化和细胞内分子的易位。 Epic 系统使捕捉成为可能当将Hpc亚型添加到预先接种在96孔无标记测量微孔板中的A-3细胞系中并实时监测DMR时，只有添加了HPC-25的系统显示出动态质量重新分布。 ・显示一个改变。通过这种方式，我们能够构建一个系统，使我们能够直接量化样品中 HPC-25 的浓度作为生物活性。