タンパク質機能解明を指向した新規タンパク質選択的ラベル化法の開拓

开发一种新型蛋白质选择性标记方法，旨在阐明蛋白质功能

基本信息

批准号：
13J07086
负责人：
傳田将也
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、プロテオーム中での機能未知タンパク質 (標的タンパク質) 選択的ラベル化を可能とするラベル化試薬 SEAlide-based labeling tag (SEAL-tag) の開発を目的としている。昨年度は、標的モデルタンパク質human carbonic anhydrase 1 (hCA1) のSEAL-tagによるラベル化およびラベル化されるアミノ酸残基の同定に取り組み、137番目のLys選択的にラベル化が進行することを明らかとした。さらに、赤血球細胞内のhCAのラベル化にも取り組み、ラベル化効率に課題を残すもののhCA選択的ラベル化を達成した。これらの結果を受け本年度は、生細胞内での標的タンパク質のラベル化に取り組むこととした。標的タンパク質として、FKBP12を選択し、A549細胞内でのラベル化を計画した。第一段階として、FKBP12の合成リガンドであるSLFの合成に取り組んだ。DL-Pipecolinic acidを出発原料として、光学分割を含む数工程を経て、SLFの合成を行った。続いて、SLFをリジン側鎖アミノ基へ導入後、Fmoc固相合成法により、SLFをリガンドとして有するSEAL-tagの合成を達成した。合成したSEAL-tagを用いて、A549細胞ライセート中のFKBP12のラベル化を行ったところ、選択的なラベル化を確認した。続いて、A549細胞中のFKBP12選択的ラベル化に取り組んだが、細胞内でのラベル化は観察されなかった。SLFの大量合成が煩雑な事から、再度標的タンパク質をhCAに変更し、細胞内でのラベル化に取り組む事とした。MCF7細胞中にhCAが発現することが過去に報告されていることから、MCF7細胞を用いることとした。MCF7細胞培養後、SEAL-tagとインキュベートし、hCAのラベル化をSDS-PAGEで確認した。その結果、細胞内タンパク質であるhCA2のラベル化は観察されなかったものの細胞膜構成タンパク質であるhCA12のラベル化を確認した。これら研究結果をもとに、現在論文投稿の準備中である。

这项研究旨在开发标签试剂，基于密封剂的标签标签（密封标签），该标签允许在蛋白质组中选择性标记未知功能蛋白（靶蛋白）。去年，我们研究了靶模型蛋白质人类碳酸性赤铁酶1（HCA1）的标记标签标记和鉴定，揭示了Lys在LYS上的标记在137位置选择性进展。此外，我们还致力于在红细胞中标记HCA的HCA，并在挑战质量方面效果效果，并在挑战质量方面进行了质疑。基于这些结果，今年我们决定将活细胞内的靶蛋白标记。选择FKBP12作为靶蛋白，并计划在A549细胞中标记。作为第一步，我们研究了SLF的合成，SLF是FKBP12的合成配体。使用DL-Pipecolinic酸作为起始材料，在包括光学分辨率在内的几个步骤后合成了SLF。随后，将SLF引入赖氨酸侧链氨基组后，通过FMOC固相合成实现了包含SLF的密封标签的合成。使用合成的密封标签，将FKBP12标记为A549细胞裂解物，并确认选择性标记。随后，解决了A549细胞中的FKBP12选择性标记，但未观察到细胞内标记。由于SLF的质量合成很复杂，因此再次将靶蛋白更改为HCA，并在细胞内进行标记。由于据报道HCA过去在MCF7细胞中表达，因此使用了MCF7细胞。在培养MCF7细胞后，将细胞与密封标签一起孵育，并通过SDS-PAGE确认HCA的标记。结果，未观察到HCA2（一种细胞内蛋白）的标记，但是证实了HCA12（细胞膜成分蛋白）的标记。基于这些研究结果，目前正在准备本文。