タンパク質機能解明を指向した新規タンパク質選択的ラベル化法の開拓

开发一种新型蛋白质选择性标记方法，旨在阐明蛋白质功能

基本信息

批准号：
13J07086
负责人：
傳田将也
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、プロテオーム中での機能未知タンパク質 (標的タンパク質) 選択的ラベル化を可能とするラベル化試薬 SEAlide-based labeling tag (SEAL-tag) の開発を目的としている。昨年度は、標的モデルタンパク質human carbonic anhydrase 1 (hCA1) のSEAL-tagによるラベル化およびラベル化されるアミノ酸残基の同定に取り組み、137番目のLys選択的にラベル化が進行することを明らかとした。さらに、赤血球細胞内のhCAのラベル化にも取り組み、ラベル化効率に課題を残すもののhCA選択的ラベル化を達成した。これらの結果を受け本年度は、生細胞内での標的タンパク質のラベル化に取り組むこととした。標的タンパク質として、FKBP12を選択し、A549細胞内でのラベル化を計画した。第一段階として、FKBP12の合成リガンドであるSLFの合成に取り組んだ。DL-Pipecolinic acidを出発原料として、光学分割を含む数工程を経て、SLFの合成を行った。続いて、SLFをリジン側鎖アミノ基へ導入後、Fmoc固相合成法により、SLFをリガンドとして有するSEAL-tagの合成を達成した。合成したSEAL-tagを用いて、A549細胞ライセート中のFKBP12のラベル化を行ったところ、選択的なラベル化を確認した。続いて、A549細胞中のFKBP12選択的ラベル化に取り組んだが、細胞内でのラベル化は観察されなかった。SLFの大量合成が煩雑な事から、再度標的タンパク質をhCAに変更し、細胞内でのラベル化に取り組む事とした。MCF7細胞中にhCAが発現することが過去に報告されていることから、MCF7細胞を用いることとした。MCF7細胞培養後、SEAL-tagとインキュベートし、hCAのラベル化をSDS-PAGEで確認した。その結果、細胞内タンパク質であるhCA2のラベル化は観察されなかったものの細胞膜構成タンパク質であるhCA12のラベル化を確認した。これら研究結果をもとに、現在論文投稿の準備中である。

本研究的目的是开发一种标记试剂，基于 SEAlide 的标记标签 (SEAL-tag)，能够选择性标记蛋白质组中未知功能的蛋白质（目标蛋白质）。去年，我们对目标模型蛋白人碳酸酐酶1（hCA1）进行了SEAL标签标记，并鉴定了待标记的氨基酸残基，发现标记选择性地在第137位Lys上进行。此外，我们致力于标记红细胞中的 hCA，并实现了 hCA 的选择性标记，尽管标记效率仍然存在问题。基于这些结果，今年我们决定致力于标记活细胞内的靶蛋白。我们选择FKBP12作为靶蛋白并计划在A549细胞中标记它。第一步，我们合成了 SLF，这是 FKBP12 的合成配体。以DL-哌啶酸为起始原料，通过光学拆分等几个步骤合成了SLF。随后，将SLF引入赖氨酸侧链的氨基后，通过Fmoc固相合成合成了以SLF作为配体的SEAL-标签。当使用合成的SEAL标签标记A549细胞裂解物中的FKBP12时，证实了选择性标记。接下来，我们尝试在 A549 细胞中选择性标记 FKBP12，但没有观察到细胞内标记。由于SLF的大规模合成较为复杂，我们决定将目标蛋白再次改为hCA，并致力于细胞内标记。我们决定使用MCF7细胞，因为之前有报道hCA在MCF7细胞中表达。培养MCF7细胞后，将它们与SEAL标签一起孵育，并通过SDS-PAGE确认hCA标记。结果，没有观察到细胞内蛋白质hCA2的标记，但确认了细胞膜构成蛋白质hCA12的标记。基于这些研究结果，我们目前正在准备提交一篇论文。