生体内増幅アンチセンスRNAを用いる脳機能解析法の開発
开发使用体内扩增反义RNA的脑功能分析方法
基本信息
- 批准号:09878176
- 负责人:
- 金额:$ 1.22万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Exploratory Research
- 财政年份:1997
- 资助国家:日本
- 起止时间:1997 至 1999
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
本研究の目的は生体の脳内局所においてアンチセンスRNAを増幅させることにより、その脳局所機能を一時的に停止させ、当該脳領域の機能解析を実現することにある。まず、溶液中でのRNAポリメラーゼ増幅反応によるcRNAの増幅を確認した後、バゾプレッシン特異的配列に対するホスホロチオエート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドを脳内投与し、バゾプレッシン機能を抑制しうる有望な配列を見いだした。この配列を用いて逆転写酵素およびジゴキシゲニン標識dUTPを含むヌクレオチド基質と共にラットの室傍核に微量投与し、一本鎖cDNAの生成条件を検討した。ラットをかん流固定し、取り出した脳からクリオスタット切片を作製し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。投与・反応条件の検討によって、一部の神経細胞に淡い染色が観察された。しかし、神経細胞による非特異的な取り込みである可能性を否定できず、さらに検討を重ねる必要がある。一方、より高感度のin situ mRNA検出法確立の目的で、固定切片上でのRNAポリメラーゼ増幅反応法の条件について検討を開始した。各反応ステップについて、至適反応条件を決定すべく検討を続行中である。特異的なmRNAに対するアンチセンスRNAを固定切片上で増幅し、それをセンス・プローブを用いたin situ hybridization法で検出することにより、mRNAの検出感度が飛躍的に増大するものと期待される。
这项研究的目的是放大活体大脑局部区域中的反义RNA,暂时停止其局部大脑功能,并实现对大脑区域的功能分析。首先,在溶液中通过RNA聚合酶扩增反应对CRNA进行了扩增后,在大脑中施用了加压素特异性序列的磷酸盐裂料反义寡核苷酸,并且可以抑制加压素功能的有前途的序列。该序列用于将大鼠旁牙核的微注射剂量与含有逆转录酶和二氧素标记的DUTP的核苷酸底物以及产生单链cDNA的条件。大鼠是灌注固定的,从去除的大脑中制备低温恒温器切片,并使用抗二高氧蛋白抗体进行免疫组织化学搜索。通过检查给药和反应条件,在某些神经元中观察到光染色。但是,不能排除这可能是神经元的非特异性摄取,并且需要进一步研究。另一方面,为了建立更灵敏的原位mRNA检测方法,我们开始研究固定切片上RNA聚合酶扩增反应方法的条件。每个反应步骤都在继续考虑,以确定最佳反应条件。可以预期,通过将反义RNA放大到固定切片上的特定mRNA并使用感觉探针进行原位杂交来检测mRNA的检测敏感性将大大增加。
项目成果
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