生体内増幅アンチセンスRNAを用いる脳機能解析法の開発

开发使用体内扩增反义RNA的脑功能分析方法

• 批准号: 09878176
• 负责人: 安原 治
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878176/
• 关键词: アンチセンスRNA; RNAポリメラーゼ; 脳機能解析法; バゾプレッシン; T7プロモーター; cRNA増幅法; ホスホロチオエート・オリゴ; ポリチミジン・オリゴヌクレオチド; バゾブレッシン; ホスホロチオエ-トオリゴ; ポリチミジン・オリゴヌクレオテド; CRNA増幅法

本研究の目的は生体の脳内局所においてアンチセンスRNAを増幅させることにより、その脳局所機能を一時的に停止させ、当該脳領域の機能解析を実現することにある。まず、溶液中でのRNAポリメラーゼ増幅反応によるcRNAの増幅を確認した後、バゾプレッシン特異的配列に対するホスホロチオエート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドを脳内投与し、バゾプレッシン機能を抑制しうる有望な配列を見いだした。この配列を用いて逆転写酵素およびジゴキシゲニン標識dUTPを含むヌクレオチド基質と共にラットの室傍核に微量投与し、一本鎖cDNAの生成条件を検討した。ラットをかん流固定し、取り出した脳からクリオスタット切片を作製し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。投与・反応条件の検討によって、一部の神経細胞に淡い染色が観察された。しかし、神経細胞による非特異的な取り込みである可能性を否定できず、さらに検討を重ねる必要がある。一方、より高感度のin situ mRNA検出法確立の目的で、固定切片上でのRNAポリメラーゼ増幅反応法の条件について検討を開始した。各反応ステップについて、至適反応条件を決定すべく検討を続行中である。特異的なmRNAに対するアンチセンスRNAを固定切片上で増幅し、それをセンス・プローブを用いたin situ hybridization法で検出することにより、mRNAの検出感度が飛躍的に増大するものと期待される。

本研究的目的是在生物体大脑中局部扩增反义RNA，从而暂时停止局部大脑功能，实现相关大脑区域的功能分析。首先，在通过溶液中的RNA聚合酶扩增反应确认cRNA的扩增后，将针对加压素特异性序列的硫代磷酸化反义寡核苷酸注射到脑内，发现了能够抑制加压素功能的有希望的序列。利用该序列，我们将少量的物质与含有逆转录酶和地高辛标记的 dUTP 的核苷酸底物一起注射到大鼠的室旁核中，以检查单链 cDNA 产生的条件。对大鼠进行灌注和固定，从取出的大脑中制备低温切片并使用抗地高辛抗体进行免疫组织化学检查。在检查给药和反应条件时，在一些神经元中观察到微弱的染色。但不能排除神经元非特异性摄取的可能性，还需要进一步研究。同时，为了建立更灵敏的原位mRNA检测方法，我们开始研究固定切片上RNA聚合酶扩增反应的条件。目前正在进行研究以确定每个反应步骤的最佳反应条件。通过在固定切片上扩增针对特定mRNA的反义RNA并使用有义探针通过原位杂交进行检测，预计mRNA检测的灵敏度将显着提高。