グルコーストランスポーターの細胞内輸送を制御する分子機構に関する細胞形態学的研究

细胞形态学研究控制细胞内葡萄糖转运蛋白转运的分子机制

• 批准号: 08770003
• 负责人: 鈴木 雅一
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08770003/
• 关键词: グルコーストランスポーター; GLUT4; 3T3-L1細胞; DAMP

3T3-L1細胞を安定して脂肪細胞に分化させるには厳密な条件設定が必要である。今回は国立健康栄養研究所江崎治部長より状態の良い3T3-L1細胞を入手し、当研究室での実験系を確立した。脂肪細胞への分化はコンフルエントにした3T3-L1細胞を2日間0.5mM3-isobutyl-1-methyl-xanthine/1μ M dexamethasone/DMEMで培養し、さらに2日間1μg insulin/DMEMで培養することにより行い、脂肪滴が現れて10日目のグルコーストランスポーターGLUT4が十分産生されている細胞を用いて実験を行った。なお、二重蛍光抗体法を使用する際にはLR-whiteの準超薄切片ではバックグラウンドが多かったので、凍結準超薄切片を用いた。まず、3T3-L1脂肪細胞を1μM insulinで処理することによりGLUT4が細胞表面に移行することを観察した。次に、GLUT4の小胞とpHとの関連を調べるために、3T3-L1脂肪細胞をinsulinとDAMP(3-(2,4-dinitroanilino)-3'-amino-N-methyldipropylamine)で同時に処理し、二重蛍光抗体法を用いて検鏡した。GLUT4とpHの低い箇所を示すDAMPの分布には明瞭な一致は観察されなかったが、10μM,25μM,50μM,100μMの濃度でDAMPを加えると濃度が高いほどGLUT4の細胞表面への移行が阻害される傾向がみられた。この結果はGLUT4のトランスロケーションが細胞内小胞のpHを中和することにより阻害される可能性を示唆している。

需要严格的条件才能设置3T3-L1细胞以稳定地分化为脂肪细胞。这次，我们从国家卫生与营养研究所Ezaki Osamu总监Ezaki Osamu获得了3T3-L1细胞，并在我们的实验室建立了一个实验系统。通过在0.5 mM 3-异丁基-1-甲基 - 黑氨酸/1μM地塞米松/DMEM中培养汇合3T3-L1细胞进行融合3T3-L1细胞进行分化2天，然后将1μg胰岛素/DMEM孵育2天。使用脂质液滴完全产生的细胞进行实验，并在第10天产生葡萄糖转运蛋白glut4。当使用双荧光免疫测定时，在LR-White的半粉末切片中大部分观察到了背景，因此使用了冷冻的半粉状切片。首先，我们观察到GLUT4通过用1μM胰岛素处理3T3-L1脂肪细胞来迁移到细胞表面。接下来，为了研究GLUT4囊泡与pH之间的关联，将3T3-L1脂肪细胞同时用胰岛素和潮湿（3-（2,4-二硝基氨基）-3'-氨基-N-甲基二吡咯胺）处理，并使用双重免疫荧光进行检查。尽管在显示GLUT4和低pH位点的潮湿的分布之间没有明确的一致性，但是当以10μM，25μM，25μM，50μM和100μM的浓度加入潮湿时，浓度越高，浓度越高，越可能抑制GLUT4的迁移到细胞表面。该结果表明，通过中和细胞内囊泡的pH值可以抑制GLUT4易位。