酵母の分泌タンパク質高次構造形成過程に関与する因子の解析

酵母分泌蛋白高级结构形成因素分析

基本信息

批准号：
08760071
负责人：
舘川宏之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、これまで酵母PDIに関する研究を行い、PDIが生育に必須であることを示した。また、ガラクトース依存性PDI変異株を作製し、PDIが分泌タンパク質の立体構造形成に重要な役割を果たしていることを示した。そして、作製した変異株の生育を多コピーで相補する遺伝子(マルチコピーサプレッサー遺伝子)のクローニングを行い、2つの新規遺伝子(MPD1,MPD2)を取得し、その構造を明らかにした。本研究では、Mpd1pとMpd2pの機能および関係を調べた。まず、グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として、大腸菌内で発現させることにより、Mpd1pがPDI活性を持つタンパク質であることを示した。Mpd2pは、融合タンパク質が不溶性となったため、今後検討が必要である。また、Mpd1pおよびMpd2pの活性中心様配列にin vitro mutagenesis法により変異を導入した結果、この領域がPDIの欠損のマルチコピーサプレッサーとして働く為には必須であることが明らかになった。これらより、Mpd1pとMpd2pはPDIと同様な機能を持つタンパク質であり、これらがPDIのかわりをすることによりPDIの欠損を相補することが示唆された。また、遺伝学的関係を知るため、MPD1,MPD2,EUG1遺伝子の三重破壊体酵母を作製したが、生育可能で、顕著な表現形は観察されなかった。今後は、PDI,Mpd1p,Mpd2p,Eug1pの基質特異性の違いや発現の違いを観察することにより、これらタンパク質の生体内における役割を明らかにしていく予定である。

到目前为止，我们已经对PDI进行了研究，并证明PDI对于生长至关重要。我们还产生了半乳糖依赖性的PDI突变体，表明PDI在分泌蛋白质构象的形成中起重要作用。然后，克隆了与多个拷贝相互补充的生长的基因（多拷贝抑制基因），并获得了两个新型基因（MPD1，MPD2），并揭示了这些基因的结构。在这项研究中，我们研究了MPD1P和MPD2P之间的功能和关系。首先，当在大肠杆菌中表达为带有谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白时，显示MPD1p是具有PDI活性的蛋白。 MPD2P现在不溶于融合蛋白，因此需要在将来研究。此外，通过体外诱变方法将突变引入了MPD1P和MPD2P的活动中心样序列中，并且揭示该区域对于它作为PDI缺乏症的多拷贝抑制剂至关重要。这些表明MPD1P和MPD2P是具有与PDI相似功能的蛋白质，并且通过替换PDI来补充PDI缺乏症。此外，为了了解遗传关系，制备了MPD1，MPD2和EUG1基因的三重破坏酵母，但它是可行的，没有观察到显着的表型。将来，我们计划通过观察PDI，MPD1P，MPD2P和EUG1P的底物特异性和表达的差异来阐明这些蛋白质在体内的作用。