新規アッセイ系による小胞体膜上糖鎖のフリップフロップ現象の分子機構解明

使用新的检测系统阐明内质网膜上糖链翻转现象的分子机制

基本信息

批准号：
22KJ3010
负责人：
佐野加苗
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Ritsumeikan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物アスパラギン結合型糖鎖の生合成過程において、小胞体膜に挿入されたドリコールピロリン酸結合型糖鎖（Dolihol pyrophosphate Linked Oligosaccharide; DLO）は細胞質側から内腔側へフリップフロップすることが知られている。本研究はフリップフロップの分子機構を解明すべく、膜上のDLOの挙動を追跡する小胞体膜反応場の構築を目指した。その構築手法として、リポソームのリン脂質を、酵素反応によりDLOに変換することを計画した。具体的には、（1）標識化したUDP-GlcNAc誘導体を供与体として、N-acetylglucosamine-phosphotransferase（DPAGT1）の作用でGlcNAcモノリン酸をリン脂質に対して導入し、（2）導入されたGlcNAc残基を受容体とし、endo-β-N-acetylglucosaminidase（ENGase）を用いてオキサゾリン化糖鎖を導入することとした。今年度はこれら2種類の反応系に必要な基質プローブの化学合成を行い、非リポソーム環境にて酵素反応を実施した。(１)の実験では、ドリコールモノリン酸類縁体であるシトロネロールリン酸に対し、クリックケミストリーによる標識が可能なアルキニル基を導入したUDP-N-アセチルグルコサミンプローブ（UDP-GlcNAlk）を基質として組換えDPAGT1を作用させた。その結果、DPAGT1がこの基質に対して活性を示し、非天然型構造を許容することを明らかにした。

在真核天冬酰胺连接聚糖的生物合成期间，插入内质网膜中的杜利二磷酸二磷酸连接的寡糖（DLO）是从细胞质侧向流明的侧向流明的一侧触发的。为了阐明触发器的分子机制，本研究旨在构建一个内质网膜反应场，该反应跟踪DLO在膜上的行为。作为一种施工方法，我们计划通过酶促反应将脂质体磷脂转化为DLO。具体而言，（1）将GlcNAC单磷酸用标记的UDP-GLCNAC衍生物作为供体，通过N-乙酰葡萄糖氨基氨基氨基氨基转移酶（DPAGT1）的作用引入磷脂中，并使用引入的Glcnac Rescune wistue wistue as the Hoccatue As oxazoline ggly和（2）内多β-N-乙酰葡萄糖酰胺酶（ENGASE）。今年，进行了这两种反应系统所需的底物探针的化学合成，并在非脂质体环境中进行了酶反应。在实验（1）中，使用UDP-N-乙酰葡萄糖探针（UDP-GLCNALK）进行重组DPAGT1，该探针引入了一个藻类化学，在Citronellolol磷酸盐，一种二利磷酸盐单磷酸酯拟型物（如二磷酸化学）上引入了藻类基团。结果表明，DPAGT1对此底物表现出活性并耐受非天然结构。