橋小脳低形成10型の分子病態メカニズムの解明

桥小脑发育不全10型分子病理机制的阐明

基本信息

批准号：
17K15623
负责人：
波田一誠
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

橋小脳低形成（PCH）の10型は、RNA キナーゼ CLP1 遺伝子変異によって断片化した tRNA (tRF) が核内に蓄積すること、p53 の活性化によって神経特異的に細胞死が生じることが知られている。しかしながら、この病因が tRF の蓄積によるものなのか、またCLP1 遺伝子変異がどのような経路を介して p53 を活性化しているのか、その詳細は未だ明らかにされていない。そこで本研究では、この疾患に対する治療法開発の一助となることを期待し、ヒト神経芽細胞株、ゼブラフィッシュそしてマウスをモデルに、CLP1 遺伝子変異による神経変性疾患の詳細な分子メカニズムを解明することを目的とする。平成29年度は、ヒト神経芽細胞株とゼブラフィッシュを用いた解析によって、ある tRF （xtRF）がp53 を介して神経変性を引き起こすことを見出した。そして、平成30年度は、xtRF が糖代謝経路で機能している酵素を介してp53 を活性化していることを明らかにした（Inoue et al. BBRC, 2020）。本年度では、ヒト PCH10 型の病的変異を導入したマウスの作製を試みた。申請者は PCH10 型のモデルマウスを作製するために、CRISPR/Cas9システムを利用した。具体的には、病的変異を導入した一本鎖DNAを相同組み換えのドナーとして使用し、エレクトロポレーションによって、Cas9タンパク質と変異部分をターゲットにした gRNA ともにマウスの受精卵に導入した。その結果、CLP1 の 140 番目のアルギニンが終止コドンに置き換わったマウスの作製に成功した。これは、PCH10 型の初めての哺乳動物モデルであり、これを用いたPCH10 型の病態メカニズムの全容解明及び治療法の確立が大いに期待される。

已知 10 型脑桥小脑发育不全 (PCH) 会因 RNA 激酶 CLP1 基因突变和 p53 激活而导致碎片 tRNA (tRF) 在细胞核中积聚，从而导致神经元特异性细胞死亡。然而，这种发病机制是否是由于tRF积累以及CLP1基因突变通过什么途径激活p53的细节尚未明确。因此，在本研究中，我们旨在利用人类神经母细胞系、斑马鱼和小鼠模型阐明CLP1基因突变引起的神经退行性疾病的详细分子机制，希望这有助于开发该疾病的治疗方法。目的是2017年，我们通过对人类神经母细胞系和斑马鱼的分析发现，某种tRF（xtRF）通过p53引起神经变性。在 2018 财年，我们发现 xtRF 通过在糖代谢途径中发挥作用的酶激活 p53（Inoue 等人 BBRC，2020）。今年，我们试图培育携带人类 PCH10 致病性突变的小鼠。申请人利用CRISPR/Cas9系统创建了PCH10型小鼠模型。具体来说，使用含有致病性突变的单链DNA作为同源重组的供体，通过电穿孔将针对突变区域的Cas9蛋白和gRNA导入小鼠受精卵中。结果，他们成功培育出CLP1第140位精氨酸被终止密码子取代的小鼠。这是PCH10的第一个哺乳动物模型，备受期待它将用于全面阐明PCH10的病理机制并建立治疗方法。