miRNAを指標としたALS患者運動神経細胞でのTDP-43機能喪失仮説の検証

以miRNA为指标验证ALS患者运动神经元TDP-43功能丧失假说

基本信息

批准号：
15K19480
负责人：
志賀篤
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K19480/
关键词：
ALS TDP-43 miRNA

项目摘要

筋委縮性側索硬化症 (ALS) では，運動神経細胞において，核蛋白TDP-43の核内からの消失を認める．よって病態機序として，TDP-43のmRNAやmiRNAに対する機能喪失による運動神経細胞死，が提唱されている．しかし，TDP-43の核内局在が消失したALS患者運動神経細胞にて，TDP-43のRNAに関連する機能が低下しているかは明らかでない．本申請ではmiRNAの安定性を利用し，核内局在の消失したALS患者運動神経細胞でのTDP-43機能を評価することを目的とする．本年度は，運動神経細胞におけるTDP-43機能を反映するmiRNA発現変化の同定を試みた．申請者はすでに，神経系の細胞特異的にTDP-43発現を低下させたTDP-43コンディショナルノックアウトマウスを使用した検討を行っており，野生型に比して，9個のmiRNAで有意な発現変化を確認している．一方，マウスとヒトでは，TDP-43がmiRNA発現に与える影響が異なる可能性がある．そこで本年度は，ヒトiPS細胞より分化させた運動神経細胞を対象とした検討を行うための，分化誘導法の検討を行った．既報に従い分化誘導を行い，結果，運動神経マーカーであるChATやHb9の発現を，RT-PCR法やウェスタンブロット法にて確認した．また，TDP-43遺伝子をノックアウトしたヒト運動神経細胞の作製に備えるため，AAVS1遺伝子座に，ドキシサイクリン誘導性にCas9タンパクを発現するためのカセットを挿入したヒトiPS細胞を樹立し，これが運動神経細胞に分化することを確認した．

在肌营养性侧性硬化症（ALS）中，在运动神经元中观察到核蛋白TDP-43的消失。因此，已经提出了由于TDP-43 mRNA中功能丧失而导致的运动神经元死亡是一种病理机制。但是，目前尚不清楚在ALS患者的运动神经元中，TDP-43 RNA相关功能是否降低，在ALS患者中，TDP-43的核定位消失了。该应用旨在利用miRNA的稳定性，并评估核定位消失的ALS患者的运动神经元中TDP-43功能。今年，我们试图确定反映运动神经元中TDP-43功能的miRNA表达变化。申请人已经使用TDP-43条件敲除小鼠进行了一项研究，该研究在神经系统中特别降低了TDP-43表达，并证实了与野生型相比，九种miRNA的表达发生了显着变化。另一方面，TDP-43对miRNA表达的影响在小鼠和人之间可能有所不同。因此，今年我们研究了一种研究与人IPS细胞区分的运动神经元的分化诱导方法。根据先前的报告诱导了分化，因此，RT-PCR或Western印迹证实了运动神经标记聊天和HB9的表达。此外，为了制作敲除TDP-43基因的人类运动神经元的创建，用盒子插入了AAVS1基因座中，以表达Cas9蛋白功能蛋白功能素诱导，并确认这与运动神经元区分开来，建立了人IPS细胞。