油中水滴法で作成した分子モーター封入リポソームによる運動性人工細胞モデルの構築

使用油包水法创建的分子马达封装脂质体构建运动人工细胞模型

基本信息

批准号：
20034024
负责人：
瀧口金吾
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

アクチンをはじめとする細胞骨格ネットワークは、細胞の形態調節や運動発生に重要な役割を果たしている。その機構を明らかにするための構成的アプローチとして、内部に細胞骨格蛋白質を組み込んだ巨大リボソームの作成を通して、人工細胞運動モデル系を構築する試みがなされ、その成果として、リボソーム内にアクチンとアクチン線維束化蛋白質を封入しアクチンの束を重合形成させることによって、一定の形態をリボソームに誘導できることが明らかにされてきた。しかしNatural swellingやElectroformationなどの従来の巨大リボソーム調製法では、大きな蛋白質複合体を組込めない、生物に重要なMg^<2+>のような2価の陽イオンの存在下や生理的塩強度下では作成効率が落ちる、などの重大な問題があり、分子モーターの系への導入が困難だった。本研究ではそれらを克服するため、Spontaneous transfer法を利用することによって、任意の濃度のアクチンとHeavy meromyosin(HMM)を同時に組込んだ巨大リボソームを生理的な塩強度下で作製することに成功した。HMMはモータードメインを2個持ち、アクチン線維間に滑りを起こすことでアクチン線維の束を運動させることが出来る。分子モーターの駆動に必要なATPは、細菌由来の膜穿孔性毒素、α-Hemolysinを利用してリボソーム内に導入した。α-Hemolysinは脂質二重膜に侵入して7量体を形成し、ATPや小さなペプチドまでもが通過可能な直径が2nmを超えるチャネルを形成する。ATPの導入添加後、リボソーム内部で形成していたアクチン線維のネットワークが変形・再配置することを観察することに成功した。

包括肌动蛋白的细胞骨架网络在调节细胞形态和产生运动方面发挥着重要作用。作为阐明该机制的结构方法，人们尝试通过创建内部掺有细胞骨架蛋白的巨型核糖体来构建人工细胞运动模型系统。聚合肌动蛋白束。然而，常规的巨型核糖体制备方法例如自然膨胀和电形成不能掺入大的蛋白质复合物，或者在对活生物体很重要的二价阳离子例如Mg 2+ 的存在下，或者在生理盐强度下。条件下，存在生产效率下降等严重问题，导致分子电机难以引入系统。在本研究中，为了克服这些问题，我们通过使用自发转移方法成功地创建了在生理盐强度下同时掺入任意浓度的肌动蛋白和重肌球蛋白（HMM）的巨型核糖体。 HMM 有两个运动域，可以通过引起肌动蛋白纤维束之间的滑动来移动肌动蛋白纤维束。使用α-溶血素（一种源自细菌的膜穿透毒素）将驱动分子马达所需的 ATP 引入核糖体中。 α-溶血素侵入脂质双层膜并形成七聚体，形成直径超过2 nm的通道，甚至ATP和小肽也可以通过。引入并添加ATP后，我们成功观察到核糖体内部形成的肌动蛋白纤维网络发生变形和重新排列。