活性型低分子量GTPaseの細胞内局在の網羅的定量解析技術の開発とその応用

活性低分子GTP酶细胞内定位综合定量分析技术开发及其应用

基本信息

批准号：
20016016
负责人：
佐藤孝哉
金额：
$ 4.74万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20016016/
关键词：
Rac1 Rho Rap1 インスリン骨格筋糖取り込み血管形成中心体 Racl Ras Rapl

项目摘要

本年度は、これまでに我々が確立した内在性Rac1およびRap1の活性化の可視化技術を応用して、これらの分子が担う生理機能の解析を推進した。まず、昨年度に引き続き、骨格筋細胞におけるインスリン刺激に応答した糖取り込み誘導のシグナル伝達系におけるRac1の機能解析を行った。具体的には、骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスとコントロールマウスにおいて、蛍光標識したGLUT4レポーターを用いたインスリン応答性のアッセイを行った。その結果、骨格筋特異的rac1ノックアウトマウスにおいては、インスリンを尾静注することによって誘導されるGLUT4の細胞膜移行が完全に抑制されたが、活性型変異体Rac1による移行は阻害されなかった。本年度は別の種類の(遺伝子型が異なる)コントロールマウスにおいてもインスリン応答性に異常のないことを確認した。これらの結果より、インスリン刺激した際のマウス骨格筋での糖取込みの誘導において、Rac1の活性化が必要十分であることが強く示唆された。また、rac1ノックアウトマウスでは、インスリン応答性のAktやAS160のリン酸化には異常は認められず、この経路はRac1を介する系とは独立であることが示唆された。さらに、Rac1の活性化部位の可視化技術をマウスの骨格筋に応用し、インスリン応答性のRac1活性化部位を同定する手法の開発も進めた。一方、RhoAに対するGEFであるARHGEF10の細胞周期調節系における役割の検討も進めた。siRNAによってこの分子をノックダウンすると、中心体の複製に異常が生じ、分裂装置が多極化することが明らかとなった。したがって、ARHGEF10は、RhoAを介して、中心体の過剰な複製を抑制していると考えられる。

今年，我们应用了已经建立的技术来可视化内源性 Rac1 和 Rap1 的激活，以促进对这些分子所发挥的生理功能的分析。首先，继去年之后，我们对信号转导系统中的 Rac1 进行了功能分析，该信号转导系统响应骨骼肌细胞中的胰岛素刺激而诱导葡萄糖摄取。具体来说，我们使用荧光标记的 GLUT4 报告基因在骨骼肌特异性 rac1 敲除小鼠和对照小鼠中进行了胰岛素反应性测定。结果，在骨骼肌特异性rac1敲除小鼠中，尾静脉注射胰岛素诱导的GLUT4向细胞膜的易位被完全抑制，但活性突变体Rac1的易位未被抑制。今年，我们证实另一种类型（不同基因型）的对照小鼠的胰岛素反应性没有异常。这些结果强烈表明，在胰岛素刺激下，Rac1 的激活对于诱导小鼠骨骼肌中葡萄糖的摄取是必要且充分的。此外，在 rac1 敲除小鼠中，胰岛素反应性 Akt 或 AS160 磷酸化没有观察到异常，表明该途径独立于 Rac1 介导的系统。此外，我们将Rac1激活位点的可视化技术应用于小鼠骨骼肌，开发了一种识别胰岛素反应性Rac1激活位点的方法。同时，我们还研究了RhoA的GEF ARHGEF10在细胞周期调控系统中的作用。结果表明，用 siRNA 敲除该分子会导致中心体复制和分裂装置多极化缺陷。因此，ARHGEF10被认为通过RhoA抑制中心体的过度复制。