選択的スプライシングを受ける遺伝子の探索とシス・エレメントの体系的解析

寻找选择性剪接基因并系统分析顺式元件

基本信息

批准号：
20016007
负责人：
黒柳秀人
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

mRNA前駆体(pre-mRNA)の選択的スプライシングは、ひとつの遺伝子から多様なタンパク質を造り出す機構で、多細胞生物の比較的少ない遺伝子からタンパク質発現の時間的・空間的多様性を生み出すための最も重要な機構のひとつである。生体内の各細胞における各遺伝子の選択的スプライシングは、トランスの制御因子とそれらが認識する転写産物上の配列または構造情報(シス・エレメント)により制御されるが、その分子機構の全容解明が今後の重要な課題である。本研究課題では、スプライシング制御に関わる塩基配列の解明を目指す。そのために、選択的スプライシング制御因子の変異体線虫を用い、i)野生型と変異体でそれぞれ発現しているmRNAのアイソフォームを大量・高速に比較することで、制御因子の標的となっている可能性がある遺伝子を網羅的に探索するための実験的・情報学的方法論の開発し、実験的に検証を行って標的遺伝子を同定すること、ii)同定した標的遺伝子の塩基配列を基に、選択的スプライシングを制御するシス・エレメントの配列を生物情報学的に予測し、予測されたエレメントの必要性や制御されるエクソンとの相対的位置関係、他のシス・エレメントとの協調性について実験的に検証すること、を行い、生体における選択的スプライシングの時間的空間的制御に必要な配列・構造情報の規則性を明らかにすることを目的としている。今年度は、主に、次世代シーケンサ-を用いたトランスクリプトーム解析を野生型およびスプライシング変異体の線虫に対して行うことを目指して、異なる株でRNA調製の条件を揃えるための飼育方法の検討や、抽出した全RNAから次世代シーケンサー解析にかけるためのDNA断片ライブラリーの作製方法の検討を行った。そして、その方法に従って野生型株N2、代表者らが同定したFox-1ファミリースプライシング制御因子ASD-1とFOX-1の二重変異体、およびasd-2変異体について、cDNAライブラリーを作製した。現在、このcDNAライブラリーを利用して、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行っている。

mRNA前体的替代剪接（PREMRNA）是一种从单个基因中产生多种蛋白质的机制，并且是从多细胞生物体中相对较少的基因产生蛋白质表达的时间和空间多样性的最重要机制之一。或者，每个细胞中每个基因的剪接都由反式调节剂控制，以及在他们识别的转录本上的序列或结构信息（CIS元素），但是阐明将来的完整分子机制将是一个重要的问题。该研究主题旨在阐明剪接控制中涉及的核苷酸序列。为此，我们使用替代剪接调节剂的突变nematodes，并旨在阐明序列和结构信息的规律性以及对野生类型和突变体在野生型和突变体中表达的mRNA同工型的必要条件和空间控制所必需的，并通过i）通过实验和信息进行实验性搜索，以实验性和信息的定位为目标，以实验性地搜索范围，以实验性地搜索范围的范围，以实验性地进行探索，以实验性地进行探索，以实验性地进行检测，从而实现对基因的影响，从而实现了范围的范围，从而实现了对基因的影响，从而实现了较大的定位，从而实现了范围的范围。基因和ii）生物信息上预测基于确定的靶基因的核苷酸序列控制替代剪接的顺式元件的序列，并通过实验验证预测元件的必要性，相对位置与受控外显子的相对位置关系，以及与其他CIS元素的合作。今年，我们主要旨在使用野生型和剪接突变型线虫的下一代测序仪进行转录组分析，并检查了育种方法，以确保满足不同菌株中的RNA制备条件，还检查了为下一代序列序列序列分析的DNA片段的研究方法，从而从提取序列分析的总RNA中进行了DNA片段。然后根据野生型菌株N2的方法，FOX-1家族剪接调节剂ASD-1和FOX-1的双重突变体以及由代表确定的ASD-2突变体生成cDNA文库。当前，使用此cDNA库使用下一代序列仪进行转录组分析。