膜タンパク質会合過程の高速AFMイメージング

膜蛋白缔合过程的高速 AFM 成像

• 批准号: 19042009
• 负责人: 内橋 貴之
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042009/
• 关键词: 生物物理; AFM; 蛋白質

1. バクテリオロドプシン(bR)の構造変化の観察 : 光吸収サイクルが野性型bRよりも遅いD96N変異体を試料として、緑色レーザー光照射時の光吸収に伴う構造変化の観察を行った。細胞質側では光照射に同期してAFMで観察されるモノマーの輝点が約0.7nm変化することがわかった。光励起された分子の寿命を解析した結果、AFMで観察された構造変化は、基底状態からN中間体への遷移時に発生すると考えられている、EFループの移動であることが分かった。一方、このような構造変化は細胞外側では観察されなかった。また、EFループの移動により隣り合ったbRトライマー内のモノマー同士が相互作用した結果、励起分子の寿命が変化することが分かり、従来から分光法により議論されてきた光吸収サイクルの協同性が構造変化に起因することを明らかにした。2. ロドプシンの会合状態の観察 : 高速AFMでロドプシンの高分解能な動態変化過程や生理過程を捉えるため、AFM観察に適したロドプシン試料の調整としてウシロドプシンの抽出及び天然脂質膜へ再構成を行った。その結果、再構成時の脂質割合や界面活性剤の割合などの条件を変える事で2次元結晶の結晶化度が変化する事が分かった。また、天然の円盤膜中に存在するロドプシンでも、4℃で長時間インキュベーションを行うと2次元結晶化し、ダイマー構造をとることが確認できた。3. ATPaseの回転観察の試み : リジン基で修飾したF1モーターを用いることで、アミノシランおよびグルタルアルデヒド処理したマイカに比較的容易に固定できることが分かった。F1のYサブユニットに標識としてストレプトアビジンを固定し、ATP加水分解による回転運動を観察することができた。しかしながら、AFM観察によりYサブユニットが容易に引き抜かれてしまうことも判明し、再現性よく回転観察を行うところまでは達しなかった。

1.细菌视紫红质(bR)结构变化的观察：使用比野生型bR具有更慢光吸收周期的D96N突变体，我们观察到在绿色激光照射下与光吸收相关的结构变化。发现在细胞质侧，通过AFM观察到的单体亮点与光照射同步地变化了约0.7nm。对光激发分子寿命的分析表明，AFM 观察到的结构变化是由于 EF 环的移动造成的，这被认为发生在从基态到 N 中间体的转变过程中。另一方面，在细胞外没有观察到这种结构变化。此外，还发现，由于EF环的移动，相邻bR三聚体中的单体之间的相互作用导致激发分子的寿命发生变化。这表明这是由变化引起的。 2.视紫红质缔合状态的观察：为了利用高速AFM高分辨率捕获视紫红质的动态变化和生理过程，提取牛视紫红质并重构到天然脂膜中，制备适合AFM的视紫红质样品观察。结果发现，通过改变重构过程中的脂质比例和表面活性剂比例等条件，可以改变二维晶体的结晶度。还证实，天然椎间盘膜中存在的视紫红质在4℃下长时间孵育时会发生二维结晶并形成二聚体结构。 3.尝试观察ATP酶的旋转：通过使用用赖氨酸基团修饰的F1马达，发现它可以相对容易地固定在经氨基硅烷和戊二醛处理的云母上。链霉亲和素作为标记固定在F1的Y亚基上，可以观察到ATP水解引起的旋转运动。然而，我们还发现，通过AFM观察，Y亚基很容易被拉出，并且无法进行具有良好再现性的旋转观察。

项目成果

Protein Dynamics Captured by High-speed AFM

高速 AFM 捕获蛋白质动力学

• 发表时间: 2007
• 作者: T.Uchihashi;N.Kodera;H.Itoh;H.Yamashita;T.Ando;T. Uchihashi and T. Ando
• 通讯作者: T. Uchihashi and T. Ando

High-speed atomic force microscopy for observing dynamic biomolecular processes

• DOI: 10.1002/jmr.843
• 发表时间: 2007-11-01
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION
• 影响因子: 2.7
• 作者: Ando, Toshio;Uchihashi, Takayuki;Yamashita, Hayato
• 通讯作者: Yamashita, Hayato

"Single Molecule Dynamics in Life Science", T. Yanagida & Yoshiharu Ishii (Eds.)

“生命科学中的单分子动力学”，T. Yanagida

• 发表时间: 2008
• 作者: T. Ando;T. Uchihashi;N. Kodera;D. Yamamoto;M. Taniguchi;A. Miyagi;H. Yamashita
• 通讯作者: H. Yamashita

High-speed atomic force microscopy for nano-visualization of dynamic biomolecular processes

• DOI: 10.1016/j.progsurf.2008.09.001
• 发表时间: 2008-11-01
• 期刊: PROGRESS IN SURFACE SCIENCE
• 影响因子: 6.4
• 作者: Ando, Toshio;Uchihashi, Takayuki;Fukuma, Takeshi
• 通讯作者: Fukuma, Takeshi

High-speed AFM and nano-visualization of biomolecular processes

• DOI: 10.1007/s00424-007-0406-0
• 发表时间: 2008-04-01
• 期刊: PFLUGERS ARCHIV-EUROPEAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY
• 影响因子: 4.5
• 作者: Ando, Toshio;Uchihashi, Takayuki;Yamashita, Hayato
• 通讯作者: Yamashita, Hayato