染色体ダイナミクスの生化学・構造生物学的解析

染色体动力学的生化和结构生物学分析

基本信息

批准号：
19038022
负责人：
胡桃坂仁志
金额：
$ 5.7万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19038022/
关键词：
ヒストンバリアント染色体クロマチンヌクレオソーム結晶構造解析ヒストンシャペロンピストン結合ヒストン遺伝子及び染色体タンパク質と酵素生体高分子構造活性相関生体機能関連物質構造生物学生体分子立体構造解析及び予測 X線結晶解析

项目摘要

染色体の構造は細胞周期を通してダイナミックに変動している。近年、この染色体構造のダイナミクスが、遺伝子の発現制御、DNA複製、DNA組換えなどを調節するために重要な役割を果たしていることが示されてきた。本研究では、染色体ダイナミクスとDNAの機能発現との相関を、精製タンパク質群による試験管内再構成系を用いた生化学的および構造生物学的解析によって明らかにすることを目的とする。染色体高次構造の変動は、染色体の主要な構成因子である、ヒストンタンパク質群と、ヒストンに直接結合するストンシャペロンが中心的な役割を果たす。そこで、本研究では、ヒストンシャペロンとして、ヒトNAP1、NAP2、PP2Cγを選定し、これらをリコンビナントタンパク質として精製した。そして、すでに確立した精製ヒストンを用いた試験管内再構成系によって、ヒストンシャペロンのクロマチン構造形成機構を、ヌクレオソームレベルで解析した。その際、ピストンH3として、ヒトで見いだされている5種類のヒストンH3バリアント、H3.1、H3.2、H3.3、H3t、CENP-Aのすべてを精製して用いた。その結果、NAP2およびPP2Cγにはヒストンバリアント特異性が認められなかったが、NAP1はH3tによるヌクレオソーム形成に欠損を持つことが明らかになった。並行して、ピストンH3バリアントを含むヌクレオソームの結晶化を行い、精巣特異的に発現が認められるH3tを含むヌクレオソームの立体構造を決定することに成功した。また、新規ヒストン結合タンパク質を、HeLa細胞抽出液と精製ヒストンを結合したビーズを用いたプロテオミクス解析によって検索し、ヒストン結合タンパク質群のカタログを作成した。

染色体的结构在整个细胞周期中动态变化。近年来研究表明，这种染色体结构的动力学在调控基因表达、DNA复制、DNA重组等方面发挥着重要作用。本研究的目的是通过使用纯化蛋白的体外重建系统进行生化和结构生物学分析，阐明染色体动力学与 DNA 功能表达之间的相关性。染色体构象的变化是由组蛋白（染色体的主要成分）和石伴侣（直接与组蛋白结合）发挥作用的。因此，在本研究中，我们选择人NAP1、NAP2和PP2Cγ作为组蛋白伴侣，并将其纯化为重组蛋白。利用已经建立的纯化组蛋白体外重建系统，我们在核小体水平上分析了组蛋白伴侣的染色质结构形成机制。当时，人类中发现的所有五种组蛋白 H3 变体 H3.1、H3.2、H3.3、H3t 和 CENP-A 均被纯化并用作活塞 H3。结果，NAP2和PP2Cγ没有表现出组蛋白变异特异性，但NAP1被发现在H3t介导的核小体形成中存在缺陷。与此同时，我们结晶了含有活塞H3变体的核小体，并成功确定了含有H3t的核小体的三维结构，发现H3t在睾丸中特异表达。我们还使用 HeLa 细胞提取物和与纯化组蛋白结合的珠子通过蛋白质组学分析来寻找新型组蛋白结合蛋白，并创建了组蛋白结合蛋白目录。