構造変化感受性蛍光タンパク質を用いたTrk受容体リン酸化のライブイメージング

使用构象变化敏感荧光蛋白对 Trk 受体磷酸化进行实时成像

基本信息

批准号：
19037001
负责人：
谷知己
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

膜タンパク質TrkAは広く神経細胞に発現し、代表的な神経栄養因子である神経成長因子NGFの受容体として、脳神経発生の制御に不可欠のタンパク質である。NGFの結合に伴うこのタンパク質の活性化を可視化する目的で、構造変化依存的に蛍光強度を変化する円順列変異蛍光タンパク質を、構造解析から予想されるTrkA受容体の活性化依存的な構造変化部位5カ所に挿入した変異遺伝子を作成し、この遺伝子を発現させたHeLa細胞およびPC12細胞を蛍光顕微鏡で観察した。作成した遺伝子のうち、HeLa細胞膜に発現したものは、受容体C末端近傍のkpnI切断部位とC末端に蛍光タンパク質を導入したもののみであったので、これらの部位にさまざまな蛍光タンパク質変異体遺伝子を導入した遺伝子を構築し、これらの遺伝子を発現したHeLa細胞およびPC12細胞に蛍光標識NGFを投与し、細胞表面へのNGF結合量と強制発現したTrkA-GFPの発現量との相関を調べた。不思議なことに、NGF結合とTrkA-GFPの発現量の相関は、HeLa細胞とPC12細胞で得られた結果が異なり、TrkA-GFPの発現量に対して結合したNGF量をプロットした回帰直線の傾きは、PC12細胞で得られたものが、HeLa細胞で得られたもののおよそ10倍となった。このことは、HeLa細胞で発現したTrkA-GFPは、NGF結合能が低下している事を示している。PC12細胞に2nMのNGFを投与して、発現させたTrkA-GFPの蛍光強度を経時的に計測した結果、NGF投与からの時間に従い、蛍光強度が低下する現象を発見した。この蛍光強度の時間変化を1次の指数関数でフィットすると、その時定数は172sとなった。この値は、後根節神経細胞成長円錐におけるNGF取り込みの1分子観察から推定された、TrkA活性化の時間経過とよく一致した。

膜蛋白TrkA在神经细胞中广泛表达，作为典型神经营养因子神经生长因子NGF的受体，是调节脑神经发育的必需蛋白。为了可视化该蛋白在与 NGF 结合后的激活，我们使用了一种循环排列的荧光蛋白，其荧光强度根据结构变化而变化，将突变基因插入到五个位点，并对表达该基因的 HeLa 细胞和 PC12 细胞进行了分析。使用荧光显微镜观察。在我们创建的基因中，唯一在 HeLa 细胞膜中表达的是受体 C 末端附近的 kpnI 切割位点，以及在 C 末端引入荧光蛋白的基因，因此，产生各种荧光。我们构建了引入这些基因的基因，将荧光标记的 NGF 给予表达这些基因的 HeLa 细胞和 PC12 细胞，并研究了 NGF 与细胞表面结合的量与数量之间的相关性。强制表达的 TrkA-GFP。奇怪的是，NGF 结合与 TrkA-GFP 表达水平之间的相关性在 HeLa 细胞和 PC12 细胞之间是不同的，结合的 NGF 量与 TrkA-GFP 表达水平绘制的回归线与 PC12 细胞获得的斜率约为 10 倍用 HeLa 细胞获得的结果。这表明HeLa细胞中表达的TrkA-GFP具有降低的NGF结合能力。将2nM NGF给予PC12细胞并测量表达的TrkA-GFP随时间的荧光强度，结果发现，给予NGF后荧光强度随着时间的推移而降低。当荧光强度的时间变化用一阶指数函数拟合时，时间常数为 172 s。该值与根据背根神经节神经元生长锥中 NGF 摄取的单分子观察估计的 TrkA 激活时间过程非常一致。

项目成果

期刊论文数量（11）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Trapping single molecules of GFP-tagged nerve growth factor receptor vialigands immobilized on a solid surface

捕获固定在固体表面上的 GFP 标记神经生长因子受体配体的单分子

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomomi Tani;Kenta Saito and Takeharu Nagai
通讯作者：
Kenta Saito and Takeharu Nagai

情報伝達する分子同士の向きを見る-蛍光偏光からのアプローチ-

观察信息传输分子的方向——荧光偏振的方法——

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
Zhou;X.;Babu;J. R.;da Silva;S.;Shu;Q.;Graef;I. A.;Oliver;T.;Tomoda;T.;Tani;T.;Wooten;M. W. and Wang;F.;Tomomi Tani;谷知己
通讯作者：
谷知己

リガンド結合にともなう神経成長因子受容体TrkAの構造ダイナミクスを可視化する試み

尝试可视化配体结合后神经生长因子受体 TrkA 的结构动力学

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomomi Tani;Kenta Saito and Takeharu Nagai;谷知己・斉藤健太・永井健治
通讯作者：
谷知己・斉藤健太・永井健治

An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity

DOI：
10.1038/nmeth.1317
发表时间：
2009-05-01
期刊：
NATURE METHODS
影响因子：
48
作者：
Tomosugi, Wataru;Matsuda, Tomoki;Nagai, Takeharu
通讯作者：
Nagai, Takeharu

スパイは一人で充分-蛍光タンパク質を用いた蛍光1分子イメージング(分担執筆)

一个间谍就足够了——使用荧光蛋白的荧光单分子成像（合著者）

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomomi Tani;Kenta Saito and Takeharu Nagai;谷知己・斉藤健太・永井健治;野村真未・原田慶恵・谷知己;谷知己・永井健治
通讯作者：
谷知己・永井健治

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通讯作者：
谷知己