タンパク質立体構造情報に基づく発光プローブの開発

基于蛋白质三维结构信息的发光探针的研制

基本信息

批准号：
19021046
负责人：
小澤岳昌
金额：
$ 3.33万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19021046/
关键词：
可視化分析化学生体分子バイオテクノロジー

项目摘要

個々の生体分子の細胞内や動物個体内での「構造・機能・動態」を詳細に解明することは, 現在の生命科学研究において最も重要な課題である. 本研究は, (1)タンパク質のリン酸化, (2)ペプチド切断酵素活性を, 低侵襲的に可視化するための新たなプローブ分子の開発原理を創案し, 実際に生きた動物個体内で可視化できることを目的とした.(1)緑色を発するElucN-14-3-3/Bad-McLuc1プローブを開発し、内在性コントロールとして赤色光を発する鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼ(SLRLuc)を細胞に発現させ, 同一の発光基質D-Luciferinを用いたマルチカラーイメージングを行った. 2種類のバンドパスフィルターを利用したマウスイメージングシステムを組み上げ, Bad-14-3-3間相互作用を半定量的に評価することに成功した. ElucとSLRLucは、マウス個体における二色発光イメージングに有用なツールとして利用できることを実証した.(2)本年度は環状Flucが, 生きたマウス体内のカスパーゼ-3活性の検出に応用可能であるか、さらなる検証を実施した. 環状Flucを発現するHeLa細胞をマウス背中の右側に移植した. マウスにSTS(100μg/kg体重)を腹腔内(i.p.)注射した場合に行ったところ, コントロールに対し有意な増加が見られた. 環状Flucを用いた発光イメージング法は,カスパーゼ活性をリアルタイムで高感度検出できることを実証した.

对细胞和动物中各个生物分子的结构，功能和动力学的深入阐明是当前生命科学研究中最重要的问题。这项研究旨在开发一种新的探针分子，用于对蛋白质磷酸化和（2）肽裂解酶活性的微创可视化，并允许在活动物中可视化。（1）开发了绿色发射ELUCN-14-3-3/BAD-MCLUC1探针，并在细胞中表达了红光作为内源性对照，并使用相同的发光底物D-lucferin进行多色成像。使用了两种类型的带通滤波器的鼠标成像系统。我们已经成功地评估了BAD-14-3-3的相互作用。 Eluc和slrluc证明它们可以用作小鼠个体的双分明发光成像的有用工具。（2）在今年，我们进行了进一步的验证，以查看是否可以应用圆形FLUC来检测活小鼠中的caspase-3活性。将表达圆形FLUC的HeLa细胞植入了小鼠背部的右侧。当小鼠注射STS（100μg/kg体重）腹膜内（i.p.）时，对照中观察到显着增加。我们证明，使用圆形FUC的发光成像可以以高灵敏度实时检测caspase活性。