刺激応答性蛋白質の創成と細胞内プローブへの応用

刺激响应蛋白的创建及其在细胞内探针中的应用

基本信息

批准号：
19021021
负责人：
水野稔久
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Nagoya Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19021021/
关键词：
蛋白質ナノバイオバイオテクノロジー

项目摘要

近年in vivoで利用可能な『特定基質に対するイメージングプローブ』の開発が、様々な生命現象を解く上で鍵になる事が認識されている。本申請者はこれに対し、天然蛋白質を基体に用い、これに様々な基質応答性を付加した刺激応答性人工タンパク質の構築及び利用を考えた。プローブとして用いる天然蛋白質には、さしあたり緑色蛍光蛋白質(GFP)変異体を用い、特定基質の濃度が一定以上に上昇した際に蛍光発光が始まる変異体の設計を目指す。昨年度までに、金属イオンとの結合により大きく構造転移を起こす設計蛋白質を円順列変異を施した天然型GFPに導入する事により、金属イオンの存在下で蛍光発色が可能なGFP変異体の構築に成功している。しかしながら、認識する金属イオン選択性に関して難があったため、イオン選択性の向上を目指した変異体構築を行った。金属イオン認識サイトとなる設計蛋白質部位の配位性アミノ酸の選択検討により、これまでの変異体においては、Cu^<2+>、Zn^<2+>、Ni^<2+>の3種類のイオンともに結合可能であったが、Cu^<2+>あるいはZn^<2+>に対して高い選択性を持つ設計蛋白質部位の構築に成功した。また、Cu^<2+>に対して高い選択性の発揮される設計蛋白質部位を円順列変異を施したGFPと組み合わせる事により、今までよりもCu^<2+>に対して高い選択性を持つGFP変異体の構築にも成功した。一方で、核内レセプターリガンドをターゲットにした蛍光蛋白質変異体の構築を目指し、核内レセプターリガンドの一つであるビタミンA類と結合可能な、5本鎖コイルドコイル蛋白質を基体にした変異体蛋白質の構築に成功したが、本申請期間内で、この認識部位とGFPとを組み合わせる事による蛍光性センサー蛋白質の構築にはいたらなかった。

近年来，人们认识到开发可在体内使用的“针对特定底物的成像探针”是解决各种生物现象的关键。对此，本申请人考虑使用天然蛋白质作为底物并向其添加各种底物响应性的刺激响应性人工蛋白质的构建和使用。我们最初将使用绿色荧光蛋白（GFP）的突变体作为天然蛋白作为探针，并旨在设计一种突变体，当特定底物的浓度上升到一定水平以上时，该突变体开始发射荧光。去年，我们成功构建了一种 GFP 突变体，该突变体可以在金属离子存在的情况下发出荧光，方法是引入一种设计的蛋白质，该蛋白质在与金属离子结合后会发生大的结构转变，成功地形成循环排列的天然 GFP。然而，金属离子识别选择性存在问题，因此我们构建了旨在提高离子选择性的突变体。通过检查设计的蛋白质位点中作为金属离子识别位点的协调氨基酸的选择，到目前为止，我们已经鉴定了三种类型的突变体：Cu^<2+>、Zn^<2+>和Ni^<我们成功地构建了对Cu^<2+>或Zn^<2+>具有高选择性的设计蛋白质位点。此外，通过将设计的对Cu^<2+>表现出高选择性的蛋白质位点与经过循环排列的GFP相结合，我们还成功地构建了对Cu^<2+>比以往更高的选择性。 GFP 突变体另一方面，为了构建针对核受体配体的荧光蛋白突变体，我们开发了基于五链卷曲螺旋蛋白的突变蛋白，该蛋白可以与核受体配体之一的维生素A结合。构建成功，在申请期内不可能将该识别位点与GFP结合构建荧光传感蛋白。