多光子CALIを用いたマウス脳における蛋白質機能の時空間特異的阻害法の開発

使用多光子 CALI 开发小鼠大脑中蛋白质功能的时空特异性抑制

基本信息

批准号：
18022036
负责人：
小山田正人
金额：
$ 4.61万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18022036/
关键词：
生体分子 CALI 多光子吸収蛋白質レーザー

项目摘要

Chromophore-assisted laser inactivation(CALI)は,生細胞における蛋白質の機能を時空間的に阻害する方法である。しかし,色素を抗体に結合させて行う従来のCALI法は,手技の煩雑さや非特異的不活性化の問題があり,普及していない。われわれは,多光子励起を用いることによって,EGFP融合蛋白質をCALIのターゲット蛋白質とする多光子CALIを開発した。本課題では,多光子CALIによる阻害の対象を培養細胞から生体脳へと発展させ,生体脳での蛋白質の機能を時空間選択的に阻害する方法を開発する出発点として,以下の成果を得た。(1)ギャップ結合の機能を解析する方法として,fluorescence recovery after photobleaching(FRAP)による機能解析法を確立し,多光子CALIが小さなギャップ結合(1 micrometer以下)だけでなく,大きなギャップ結合(5 micrometer以上)の機能を阻害できることを明らかにした。(2)6量体を形成し機能するギャップ結合蛋白質コネキシン(Cx)について,野生型Cx43とCx43-EGFP発現ベクターを混合してHeLa細胞に遺伝子導入を行い,多光子CALIによって内因性に発現している蛋白質の機能も抑制できることを明らかにした。(3)ラット胎児脳初代培養細胞にCx43-EGFP発現ベクターを遺伝子導入し,細胞間コミュニケーション機能をFRAPで解析しながら,多光子CALIを行うことにより,胎児脳初代培養細胞でも多光子CALIにより時空間特異的な機能阻害が可能なことを明らかにした。

发色团辅助激光灭活（CALI）是一种抑制活细胞中蛋白质功能的方法。但是，由于技术的复杂性和非特异性失活的问题，染料与抗体结合的常规CALI方法并不常见。我们开发了多光子Cali，它使用多光子激发使用EGFP融合蛋白作为Cali的靶蛋白。在这一主题中，我们通过开发一种通过开发开发一种时空方法来选择性抑制生物学大脑中蛋白质功能的方法，作为开发一种选择性抑制生物大脑中蛋白质功能的方法的起点。（1）我们在光漂白后使用荧光回收（FRAP）作为分析间隙连接功能的方法建立了一种功能分析方法，并揭示了多光子Cali不仅可以抑制小间隙连接（小于1微米），还可以抑制大间隙连接（小于5微米）。（2）关于形成和功能作为六聚体的间隙连接蛋白连接素（CX），通过混合野生型CX43和CX43-EGFP表达向量，将基因转移作为六聚体转移，并表明内源表达的蛋白质的功能也可以受到倍增曲Cai的功能。（3）通过将CX43-EGFP表达载体转染到原代培养的大鼠胎儿脑细胞中，并执行多光子Cali，使用FRAP分析细胞间通信功能，我们已经揭示了多光子Cali还可以抑制原发性培养的胎儿脑细胞中的时空特异性功能。