多光子CALIを用いたマウス脳における蛋白質機能の時空間特異的阻害法の開発

使用多光子 CALI 开发小鼠大脑中蛋白质功能的时空特异性抑制

基本信息

批准号：
18022036
负责人：
小山田正人
金额：
$ 4.61万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18022036/
关键词：
生体分子 CALI 多光子吸収蛋白質レーザー

项目摘要

Chromophore-assisted laser inactivation(CALI)は,生細胞における蛋白質の機能を時空間的に阻害する方法である。しかし,色素を抗体に結合させて行う従来のCALI法は,手技の煩雑さや非特異的不活性化の問題があり,普及していない。われわれは,多光子励起を用いることによって,EGFP融合蛋白質をCALIのターゲット蛋白質とする多光子CALIを開発した。本課題では,多光子CALIによる阻害の対象を培養細胞から生体脳へと発展させ,生体脳での蛋白質の機能を時空間選択的に阻害する方法を開発する出発点として,以下の成果を得た。(1)ギャップ結合の機能を解析する方法として,fluorescence recovery after photobleaching(FRAP)による機能解析法を確立し,多光子CALIが小さなギャップ結合(1 micrometer以下)だけでなく,大きなギャップ結合(5 micrometer以上)の機能を阻害できることを明らかにした。(2)6量体を形成し機能するギャップ結合蛋白質コネキシン(Cx)について,野生型Cx43とCx43-EGFP発現ベクターを混合してHeLa細胞に遺伝子導入を行い,多光子CALIによって内因性に発現している蛋白質の機能も抑制できることを明らかにした。(3)ラット胎児脳初代培養細胞にCx43-EGFP発現ベクターを遺伝子導入し,細胞間コミュニケーション機能をFRAPで解析しながら,多光子CALIを行うことにより,胎児脳初代培養細胞でも多光子CALIにより時空間特異的な機能阻害が可能なことを明らかにした。

发色团辅助激光灭活（CALI）是一种在空间和时间上抑制活细胞中蛋白质功能的方法。然而，传统的CALI方法涉及将染料与抗体结合，由于操作复杂且存在非特异性失活问题，因此并未得到广泛应用。我们利用多光子激发，使用EGFP融合蛋白作为CALI的靶蛋白，开发了多光子CALI。在这个项目中，我们将多光子CALI抑制的目标从培养细胞扩展到活体大脑，并获得以下结果作为开发选择性抑制活体大脑Ta中蛋白质功能的方法的起点。（1）作为分析间隙连接功能的方法，我们建立了利用光漂白后荧光恢复（FRAP）的功能分析方法，多光子CALI不仅可以分析小间隙连接（1微米或更小），还可以分析大间隙连接（ 5微米）表明上述功能可以被抑制。 (2)连接蛋白(Cx)是一种形成六聚体并发挥功能的间隙连接蛋白，通过混合野生型Cx43和Cx43-EGFP表达载体转染至HeLa细胞，并通过多光子CALI内源表达。蛋白质的功能是(3)通过将Cx43-EGFP表达载体转染至原代培养的大鼠胎儿脑细胞中并进行多光子CALI，同时使用FRAP分析细胞间通讯功能，我们证明了在原代培养的胎儿脑细胞中进行多光子CALI是可能的。功能性抑制是可能的。