コートカラーではgerm lineに伝わるが導入遺伝子は伝わらないキメラの解析

毛色传递至种系但不传递至转基因的嵌合体的分析

• 批准号: 16045213
• 负责人: 荒木 喜美
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16045213/
• 关键词: キメラマウス; ES細胞; Germline transmission; キメラマウス; ES細胞; Germline transmission

ES細胞を用いた遺伝子トラップを行う過程で得られた3つのトラップクローン、Ayu17-125,Ayu17-131,Ayu17-735は、それらのキメラマウスの仔の毛色はES由来であるにもかかわらず、トラップベクターは伝わらないという現象を示す。しかし、キメラ精子を用いた体外授精で得られた受精卵を胚盤胞まで培養、PCRでトラップベクターの有無を調べると、2-6割の確率でベクターを持つ胚が存在した。その原因解析のため、まず、Ayu17-125の体外受精で得られた胚盤胞を培養、ES細胞の樹立を試みた。267個の胚盤胞を培養、そのうちG418選択下でESとして樹立できたものは4クローンのみであった。これは、以前のPCRで得られた胚盤胞でのトラップベクター陽性率より著しく低い。これらのES細胞からキメラを作製すると、ベクターが伝わるキメラが多数得られた。この結果は、胚盤胞で行ったPCRの結果を疑わせるものである。また、トラップクローンに薬剤耐性遺伝子を導入して得られたサブクローンを調べる、という実験から、元のクローンにはトラップベクターをもっていない細胞が混入していることも明らかになった。そこで、Ayu17-131,Ayu17-735を用い、トラップベクターのβgeo遺伝子を部位特異的組換えシステムを用いてIRES-βgeo遺伝子に置換、その置換クローンでベクターが伝わるか解析を行った。その結果、両クローンともベクターが伝わるキメラが得られた。しかし、Ayu17-735(脂肪酸伸長遺伝子であるelov16をトラップしている)由来のキメラは生殖効率が非常に悪く、精子は精巣上体に十分数存在するものの、体外受精の際、HTF溶液での前培養の段階で精子の活動性が非常に落ちることがわかった。現在、この表現型がどの程度の浸透率で子孫に伝わるのかを検討中である。

使用ES细胞在基因捕获过程中获得的三个陷阱克隆，AYU17-125，AYU17-131和AYU17-735获得，表明，尽管嵌合小鼠幼崽的涂层颜色是从ES得出的，但陷阱矢量却无法传播。然而，当将使用嵌合精子的体外授精以胚胎培养以胚泡并检查陷阱载体的存在或不存在时，有20％的胚胎与矢量存在20％的可能性。为了分析原因，我们首先尝试培养通过在Ayu17-125体外受精并建立ES细胞获得的胚泡。培养了267个胚泡，其中只有4个克隆能够在G418选择下以ES确定。这显着低于从先前PCR获得的胚泡中的陷阱矢量阳性速率。当从这些ES细胞中制备嵌合体时，获得了许多嵌合体，这些嵌合体允许向载体传输。该结果推测在胚泡中执行的PCR结果。此外，通过将耐药性基因引入陷阱克隆的实验，其中检查了一个亚克隆，发现原始克隆被没有陷阱载体的细胞污染。因此，使用位点特异性的重组系统，使用AYU17-131和AYU17-735用IRES-βGeo基因代替TRAP载体的βGeo基因，并进行了分析以确定是否通过替换克隆传播了载体。结果，获得了两个克隆传输矢量的嵌合体。然而，源自AYU17-735（脂肪酸延伸基因ELOV16）的嵌合体的生殖效率很差，尽管附睾中有足够的精子，但发现精子活性在与HTF溶液的预培养过程中在体外受精过程中大大降低了精子活性。目前，我们正在考虑如何将这种表型传输到后代。