可変型遺伝子トラップにより得られた挿入突然変異マウスの解析と応用

可变基因捕获插入突变小鼠的分析及应用

• 批准号: 11780537
• 负责人: 荒木 喜美
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780537/
• 关键词: Cre; loxシステム; 挿入変異マウス; 胚性幹細胞; 遺伝子トラップ; ES細胞; 部位特異的組換え; 挿入変異; Cre; loxシステム; 挿入変異マウス; 胚性幹細胞; 遺伝子トラップ; ES細胞; 部位特異的組換え; 挿入変異

我々は、Cre-loxシステムを応用し、トラップクローン樹立後にレポーター遺伝子を任意の遺伝子に置換できる、可変型遺伝子トラップ法を開発してきた。最初に構築したベクターpU-Hachiのシステムでは、標的遺伝子挿入のために野生型loxP配列の右側の末端に変異を入れたlox66配列と左側の末端を変異させたlox71配列を用いていた。このベクターでは、レポーターのβ-geo遺伝子をcDNAに置き換えることは出来たが、トラップされた遺伝子のエクソンを利用した融合遺伝子を作ることは出来なかった。そこで、応用範囲のさらに広い有用なトラップベクターに改良するため、lox66/71とは異なるタイプの変異で、中央部のスペーサー領域に変異を入れたlox2272配列やlox511配列を組み合わせて利用することを試みた。まず、promoter+lox71+bsr-pA+lox511+lox2272というコンストラクトを1コピーもつES細胞株を樹立し、2種類の変異loxに挟まれた部分を置換する効率を検討した。その結果、lox66/71のみを介した挿入反応よりも、lox66/71とlox2272配列やlox511配列を組み合わせた置換反応の方が2-3倍効率が良いことがわかった。そこで、これらの配列を利用した新しいトラップベクターpU-17を完成した。その構造は、イントロン+lox71+スプライスアクセプター+β-geo+loxP+ポリAシグナル+lox2272+pSP73+lox511配列というもので、lox71をスプライスアクセプターの前に移動したので、5'側の部分との融合遺伝子を作ることも可能で、また、lox2272を用いた置換反応を行えば、3'側の部分と融合遺伝子を作ることも出来る。現在、このトラップベクターを用いて700クローン以上を単離し,変異マウスラインの樹立を行っている。

我们已经开发了可变的基因捕获方法，这些方法在建立陷阱克隆后，将CRE-LOX系统应用于任何基因来替代报告基因。第一个构建的矢量pu-Hachi系统使用了LOX66序列，该序列在野生型LOXP序列的右端突变，而在左端突变的LOX71序列用于靶基因插入。使用该载体，可以用cDNA替换报告基因的β-GEO基因，但是不可能使用捕获基因的外显子创建融合基因。因此，为了通过更广泛的应用来改善陷阱矢量，我们试图结合LOX2272和LOX511序列，这些序列在中央间隔区域具有突变，与LOX66/71的突变类型不同。首先，我们建立了一条ES细胞系，其中一份构造启动子+LOX71+BSR-PA+LOX511+LOX2272的副本，并研究了更换两种突变体LOX之间的零件的效率。结果，发现将LOX66/71与LOX2272和LOX511序列相结合的替代反应是单独通过LOX66/71插入反应的效率的2-3倍。因此，使用这些序列完成了新的陷阱矢量PU-17。 The structure is the intron + lox71 + splice acceptor + β-geo + loxP + polyA signal + lox2272 + pSP73 + lox511 sequence, and since lox71 has been moved in front of the splice acceptor, it is possible to create a fusion gene with the 5' portion, and by performing a substitution reaction using lox2272, a fusion gene with the 3' portion can also be created.当前，使用此陷阱矢量已经隔离了700多个克隆，并且已经建立了突变的小鼠线。