可変型遺伝子トラップにより得られた挿入突然変異マウスの解析と応用

可变基因捕获插入突变小鼠的分析及应用

基本信息

批准号：
11780537
负责人：
荒木喜美
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、Cre-loxシステムを応用し、トラップクローン樹立後にレポーター遺伝子を任意の遺伝子に置換できる、可変型遺伝子トラップ法を開発してきた。最初に構築したベクターpU-Hachiのシステムでは、標的遺伝子挿入のために野生型loxP配列の右側の末端に変異を入れたlox66配列と左側の末端を変異させたlox71配列を用いていた。このベクターでは、レポーターのβ-geo遺伝子をcDNAに置き換えることは出来たが、トラップされた遺伝子のエクソンを利用した融合遺伝子を作ることは出来なかった。そこで、応用範囲のさらに広い有用なトラップベクターに改良するため、lox66/71とは異なるタイプの変異で、中央部のスペーサー領域に変異を入れたlox2272配列やlox511配列を組み合わせて利用することを試みた。まず、promoter+lox71+bsr-pA+lox511+lox2272というコンストラクトを1コピーもつES細胞株を樹立し、2種類の変異loxに挟まれた部分を置換する効率を検討した。その結果、lox66/71のみを介した挿入反応よりも、lox66/71とlox2272配列やlox511配列を組み合わせた置換反応の方が2-3倍効率が良いことがわかった。そこで、これらの配列を利用した新しいトラップベクターpU-17を完成した。その構造は、イントロン+lox71+スプライスアクセプター+β-geo+loxP+ポリAシグナル+lox2272+pSP73+lox511配列というもので、lox71をスプライスアクセプターの前に移動したので、5'側の部分との融合遺伝子を作ることも可能で、また、lox2272を用いた置換反応を行えば、3'側の部分と融合遺伝子を作ることも出来る。現在、このトラップベクターを用いて700クローン以上を単離し,変異マウスラインの樹立を行っている。

我们已经开发了一种可变的基因陷阱方法，该方法可以应用CRE-LOX系统并用陷阱克隆树后的任何基因代替报告基因。首先建造的矢量pu-hachi系统使用了一个lox66序列，该序列在靶基因插入的野生动物LOXP序列的右端使用突变体，而LOX71序列则是突变左端的LOX71序列。在该载体中，报告基因β-GEO基因被cDNA取代，但不可能使用捕获的基因exonson创建融合基因。因此，为了将其改进到应用范围内的更有用的陷阱向量，它是多种类型的LOX66/71，它是尝试使用LOX2272序列和LOX511序列，并在隔离区域中具有突变的LOX511序列中心。首先，我们检查了建立一个ES细胞副本的效率，称为启动子+LOX71+BSR-PA+LOX511+LOX2272，并更换夹在两种突变LOX之间的零件。结果，发现结合LOX66/71，LOX2272和LOX511序列的替换反应比通过LOX66/71的插入反应更好。因此，完成了使用这些阵列的新陷阱向量PU-17。它的结构是内含子+lox71+剪接附件+β-Geo+loxp+poly a信号+lox2272+psp73+lox511，因此lox71已移动到弹簧附件，因此可以与5'部分融合。一个基因，如果执行了使用LOX2272的替代反应，它也可以形成3'侧和融合基因的融合。当前，该陷阱矢量被隔离为建立突变小鼠线的700多个克隆。