疎水性コア構造変換によるヘムタンパク質の耐熱性発現機構の解明

通过疏水核心结构转换阐明血红素蛋白的热稳定性表达机制

• 批准号: 14045203
• 负责人: 山本 泰彦
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14045203/
• 关键词: 熱安定性タンパク質; ヘムタンパク質; 電子伝達タンパク質; NMR; 電気化学測定; 常磁性錯体; 酸化還元電位; 人工変異体

緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)シトクロムC_<551>(PA)は、好熱性水素細菌(Hydrogenobacter thermophilus)シトクロムC_<552>(HT)とアミノ酸配列の相同性が56%と高く、高次構造も類似している。しかしながら、HTはPAに比べて熱変性温度が約40℃も高い。PAの疎水性コア内部に存在し、タンパク質の熱安定性に関与すると考えられるアミノ酸残基をHTでの対応する残基に置換した人工変異体を調製したところ、熱安定性のより高い一連の人工変異体が得られた。本研究では、PAとこれらの変異体について、標準酸化還元電位(E゜^1)およびNMRスペクトルのpH依存性を比較検討し、疎水性コア内部におけるアミノ酸置換がシトクロムcの機能と構造に与える影響を解析した。シトクロムcのヘムの配位構造、ヘム近傍の構造化学的性質とE゜^1の関係を明らかにするために、サイクリックボルタンメトリーによりE゜^1のpH依存性を測定した。PAのE゜^1はpHの上昇に伴い約60mV低下したが、これは酸化型タンパク質のヘムが電離したヘム側鎖プロピオン酸基により静電的に安定化されることに起因する。変異体のE゜^1のpH依存性もほぼ同様な傾向を示したが、pKaに関してF34Y/E43Y<F34Y<E43Y<PAの順になった。この結果は、ヘム側鎖プロピオン酸基のPKaがこれらの変異体で段階的に変化していることを示している。PAのヘム側鎖プロピオン酸基は側鎖に正電荷をもつアミノ酸とイオン対を形成しているが、近傍のアミノ酸を置換することにより、このイオン対の安定性を通してヘム側鎖プロピオン酸基のpKaが変化すると考えられる。これらのタンパク質のE゜^1は立体構造の安定性に依存することを私共は明らかにしている。したがって、ヘムのプロピオン酸基のpKaを調節することにより、熱安定性が高いシトクロムcにおいてE゜^1を調節することが可能であることが示された。

铜绿假单胞菌细胞色素C_ <551>（PA）的高氨基酸序列同源性与嗜热氢细菌（HT）为56％，并且在高阶结构上相似。但是，HT的热定性温度比PA高约40°C。制备了人造突变体，其中存在于PA的疏水核心内存在的氨基酸残基，并被认为与HT中的相应残基一起代替了蛋白质的热稳定性，从而导致一系列更热的人工突变体。在这项研究中，我们比较并检查了PA和这些突变体的标准氧化还原电位（E゜^1）和NMR光谱的pH依赖性，并分析了疏水核心内氨基酸取代对细胞色素c功能和结构的影响。为了阐明细胞色素C的血红素的配位结构与血红素附近的结构化学之间的关系，E゜1的pH依赖性是通过环状伏安法测量的。随着pH的增加，PA的E.Sub.1的pa降低了约60 mV，这是由于电离血红素侧链丙酸基团对氧化蛋白质血红素的静电稳定。突变体中E^1的pH依赖性显示出相似的趋势，但是关于PKA，它的pH值是f34y/e43y <f34y <e43y <pa的顺序。结果表明，在这些突变体中，血红素侧链丙酸酯组的PKA逐渐改变。 PA的血红素侧链丙酸酯丙酸基团与带正电荷侧链的氨基酸形成一个离子对，但人们认为，通过用附近的氨基酸代替，血红素侧链丙酸基团的PKA通过该离子对的稳定性而变化。我们已经表明，这些蛋白质中的E^1取决于构象的稳定性。因此，已经表明，通过调节血红素的丙酸酯基团的PKA，可以在细胞色素c中调节E゜^1，该CytoChrome C具有很高的热稳定性。

项目成果

Takako Ohyama et al.: "Study on interaction of a cationic porphyrin with DNA"Nucleic Acids Research, Supplement. 3. 189-190 (2003)

Takako Ohyama 等人：“阳离子卟啉与 DNA 相互作用的研究”《核酸研究》增刊。

Norifumi Terui et al.: "Relationship between Redox Function and Protein Stability of Cytochromes c"Journal of the American Chemical Society. 125. 13650-13651 (2003)

Norifumi Terui 等人：“细胞色素 c 氧化还原功能与蛋白质稳定性之间的关系”美国化学会杂志。

Yasuhiko Yamamoto et al.: "Influence of amino acid side chain packing on Fe-methionine coordination in thermostable cytochrome c"Journal of the American Chemical Society. 124. 11574-11575 (2002)

Yasuhiko Yamamoto 等人：“氨基酸侧链堆积对热稳定细胞色素 c 中铁-蛋氨酸配位的影响”美国化学会杂志。

山本泰彦 他: "電子伝達タンパク質シトクロムcの熱安定性と機能調節の分子機構"化学と生物. 41. 190-197 (2003)

Yasuhiko Yamamoto 等人：“电子转移蛋白细胞色素 c 的热稳定性和功能调节的分子机制”，化学与生物学，41. 190-197 (2003)。

Toshiyasu Mikuma et al.: "Coordination complex between haemin and parallel-quadruplexed d(TTAGGG)"Chemical Communications. 1708-1709 (2003)

Toshiyasu Mikuma 等人：“血红素与平行四链体 d(TTAGGG) 之间的配位复合物”化学通讯。