DNAと蛋白質の相互作用からみたセントロメア/動原体の機能分子構造

DNA-蛋白质相互作用视角下着丝粒/动粒的功能分子结构

基本信息

批准号：
09266217
负责人：
杉本憲治
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka Prefecture University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09266217/
关键词：
セントロメア動原体アルホイド CENP-A CENP-B CENP-C HP-1

项目摘要

1.CENP-AとHP1の機能構造ヒトヘテロクロマチン蛋白質HP1^<HSα>については、in vitroの解析ではあるが,N末端とC末端領域に自己会合能が認められた。また,GFPを指標に用い,in vivoにおいてもそれに対応する活性,すなわち,セントロメアへの局在性が認められた。CENP-Aについては、大腸菌による発現が非常に困難であるため,出芽酵母を用いた宿主ベクター系に変更し、その発現に成功した。2.アフィニティーDNA沈降法によるセントロメアDNAの単離CENP-B蛋白質については,アフィニティー沈降法を用い,ヒトゲノムライブラリーより単離したcos2クローンについて,由来する染色体,並びに,CENP-B結合配列の分布を解析した。この配列は染色体6番のセントロメア領域に由来し,その3kbの高次繰り返し中には7-8個のCENP-B結合配列を含み,かつ,結合配列に富む1kbの領域は他のグループにより単離されている同染色体由来のアルホイドの高次繰り返しにもよく保存されていることが判明した。また,CENP-Bの結合配列について、新たに43種の合成オリゴDNAを用いてその結合に必要なDNAの大きさ,塩基の特異性を決定した。これらは,その結合の強さにより4つのクラスに分類された。3.新たなセントロメア蛋白質をコードする遺伝子の単離動原体内層を構成する蛋白質として知られるCENP-A,Cについて,これと相互作用するような新たなセントロメア蛋白質を同定するため,出芽酵母のtwo-hybridシステムを用いてヒトcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。これらについては現在解析中である。

1. CENP-A和HP1的功能结构人异染色质蛋白HP1^<HSα>被发现在其N端和C端区域具有自缔合能力，尽管这是体外分析。此外，以GFP为指示剂，在体内也观察到了相应的活性，即向着丝粒的定位。由于使用大肠杆菌表达CENP-A非常困难，因此我们改为使用酿酒酵母的宿主载体系统并成功表达了它。 2.通过亲和DNA沉淀法分离着丝粒DNA 对于CENP-B蛋白，使用亲和沉淀法确定从人类基因组文库分离的cos2克隆的起源染色体和CENP-B结合序列的分布。该序列源自6号染色体的着丝粒区域，其3kb高阶重复包含7-8个CENP-B结合序列，而富含结合序列的1kb区域也是其他群体所独有的。在来自同一染色体的生物碱的高阶重复中很好地保守，这些生物碱是分开的。此外，关于 CENP-B 的结合序列，我们使用 43 种新的合成寡聚 DNA 确定了结合所需的 DNA 大小和碱基特异性。根据其粘合强度将它们分为四类。 3.编码新着丝粒蛋白的基因的分离为了鉴定与被称为构成着丝粒内层的蛋白质的CENP-A和C相互作用的新着丝粒蛋白，我们分离了编码新着丝粒蛋白的基因。使用双杂交系统筛选人类 cDNA 文库。目前正在对这些进行分析。