シナプス強化の過程における特異的タンパク合成の解析

突触强化过程中特异性蛋白质合成分析

基本信息

批准号：
09260211
负责人：
鈴木龍雄
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09260211/
关键词：
postsynaptic density dendrite mRNA long-term potentiation local pretein synthesis シナプス可塑性

项目摘要

ラット大脳からシナプス後肥厚部(PSD)を単離し,そこからRNAを抽出した.まずcDNAを作り、それをスターティングマテリアルとして,アイソトープ標識デオキシヌクレオチド存在下でPCRを行った.得られたPCR産物を電気泳動で分離後,オートラジオグラフィーにて検出,同定した.上記で用いた乾燥ポリアクリルアミドゲルから,個々のバンドを正確に切り取り,ゲル内に含まれる約650種のDNAを抽出・回収し,アガロースゲル電気泳動で精製した.こうして得られたDNAのうち,現在までに約150種ほどの塩基配列を決定した.DNAデータベースによるホモロジー検索の結果,23種類の遺伝子が既知のものであった.既にdendriteにmRNAが局在することが明らかにされているものの中ではMAP2が検出されていたが,他のものはそのmRNAのdendriteへの局在は報告されていないものであった.今回新たに未知の遺伝子として,しかもそのmRNAがdendriteに局在する可能性のあるものとして108個見つかった.我々はそれらを仮にDem gene(遺伝子産物はDem protein)と名付けた.それらのうち,比較的長いものの中から2種を選んで,in situ hybridization(digoxygenin法)を行いmRNAが本当にdendriteに局在するかどうかについての検証を行った.Dem-1は正常のアダルトラット脳の神経細胞に広く分布していた.さらに,カイニン酸による痙攣誘発後4時間の脳ではDem-1の発現は顕著に誘導されていた.その際,大脳皮質や海馬の錐体細胞においてはdendrite内に明らかなmRNAの発現を観察した.Dem-2においては,カイニン酸刺激前のラット脳にはmRNAを検出できなっかたが,カイニン酸刺激後4時間の大脳皮質,海馬の神経細胞において著しいmRNAの発現誘導を観察した.その場合にもやはり,発現は神経細胞の細胞体ばかりでなくdendriteにも観察された。これまでの結果から考えると,dendriteやPSD近傍に局在する遺伝子やタンパク質を同定するための方法として,我々の方法は十分に有効なものであると確認された.今後は,残りの約450種の遺伝子の塩基配列決定と,塩基配列決定のなされたものについてはin situ hybridizationやNorthern blotによる解析,さらに,full lengthを含む遺伝子のクローニングを進め,タンパクとしての機能を明らかにする計画である.

从大鼠脑大脑中分离出突触后增厚（PSD），并从中提取RNA。首先，制备cDNA，并在同位素标记的脱氧核苷酸作为起始材料的情况下进行PCR。通过电泳分离获得的PCR产物，然后通过放射自显影检测和鉴定。从上面使用的干燥聚丙烯酰胺凝胶中准确切割单个带，并提取并收集凝胶中包含的大约650种类型的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将所得的DNA承受糖。迄今为止，已经确定了大约150个基因。使用DNA数据库的同源性搜索表明已知23个基因。 MAP2已经在被发现将mRNA定位在树突中的人中发现，但是其他人没有关于将mRNA定位到树突的报道。我们发现了108个新的未知基因，并且mRNA可以定位于树突。我们决定将其用作DEM。我们命名为基因（基因产物是DEM蛋白）。这些物种中的两个是从相对较长的物种中选择的，我们原位研究了mRNA是否通过杂交定位于树突（二氧蛋白法）。 DEM-1广泛分布在正常成年大鼠大脑中的神经元中。此外，在大脑中四个小时诱导海藻酸诱导后，DEM-1的表达显着诱导。目前，我们观察到海马脑皮质和锥体细胞中树突中的明显mRNA表达。在DEM-2中，在海藻酸刺激之前无法在大鼠脑中检测到mRNA，但是在海藻酸刺激后4小时，大脑皮层和海马神经元中的mRNA表达诱导显着。在这种情况下，不仅在神经细胞的细胞体中，而且在树突中也观察到表达。考虑到迄今为止的结果，我们的方法已被证实是鉴定在树突和PSD附近定位的基因和蛋白质的方法足够有效的。将来，我们计划进行其余450个基因的测序，分析已通过原位杂交和北印迹测序的基因，以及包含全长的基因的克隆以阐明其作为蛋白质的功能。