温度感受性ヒトp53癌抑制遺伝子を用いた細胞増殖制御機構の解明

利用温度敏感的人p53抑癌基因阐明细胞增殖控制机制

基本信息

批准号：
07272215
负责人：
土田信夫
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07272215/
关键词：
癌抑制遺伝子 p53 温度感受性変異株 G1停止アポトーシス Rb

项目摘要

p53癌抑制遺伝子の変異は殆ど全てのヒト癌で最も高頻度にみられる。我々は野生型p53のもつ細胞増殖機能に解析するために、ヒトp53の138番目をアラニンからバリンに変えた温度感受性変異株(vall38)を作成し、ラット初代線維芽細胞(REF)、ヒト骨肉腫細胞(Saos-2)、ヒトT細胞白血病(Jurkat)、およびヒト赤白血病細胞(K562)に導入した。これらの細胞を低温シフトしたときの細胞増殖に対する影響を、生細胞数、DNA含量等を基に解析したところ、Jurkat細胞はアポトーシスを他の細胞はG1停止をおこしていた。なおSaos-2細胞ではG2/M停止を起こすものもかなりあった。p53によるG1停止に関してはp21cipl(waf1)の発現誘導、cdk/cyclinの阻害、Rbの脱リン酸化、E2Fとの結合を介するDNA合成開始の阻害が考えられている。G1停止をおこす細胞でp53の下流のシグナル伝達をしらべたところ、K562細胞では上記と一致する。REF細胞ではp21cip1(waf1)の発現誘導を介さない、Rbの発現のないSaos-2細胞ではRbの代わりにp130がG1停止の、シグナル伝達に係わっていることが判明した。そこでREF、Saos-2細胞でのG1停止に、またJurkat細胞でのアポトーシスに関与する遺伝子をクローシングするため、低温シフト前と後それぞれ6時間サイクロヘキシミド存在下で培養し、mRNAを精製後cDNAライブラリーを作成した。低温シフト後に野生型活性によって発現誘導されると思われる新たな遺伝子の検索をピオチン/ストレプトアビジンによるサブトラクション法を用いて試みたが得ることが出来なかった。

p53癌症控制基因突变最常在几乎所有的人类癌症中发现。为了分析野生型p53的细胞生长功能，我们创建了一个温度敏感的突变体（VALL38），将人类p53的138 p53从alanin转换为巴林，而大鼠成纤维细胞（Ref）是人类骨骼细胞（SAOS-2），人T细胞白血病（Jurkat）和人红色孤血细胞（K562）。分析细胞增殖时，根据重要细胞，DNA含量等的数量分析了这些细胞时的低温，而Jurkat细胞已停止了息肉病，而其他细胞则停止了G1。此外，还有很多SAOS-2细胞引起G2/M停止。关于具有p53的G1悬浮液，诱导P21CIPL（WAF1），CDK/Cyclin的抑制作用，RB驱逐舰以及通过与E2F结合抑制DNA合成。当在导致G1停止的细胞中检查p53下游的信号传递时，K562单元格时匹配上述。事实证明，REF细胞参与了信号传导，其中P130在没有RB表达的情况下停止了P130，而无需诱导P21CIP1（WAF1）表达。因此，为了在Ref，Saos-2细胞中停止G1，并单击Jurkat细胞中凋亡中涉及的基因，在低温转移之前和之后，它在Cycloheximide的存在下进行培养6小时，mRNA为后来我创建了一个cDNA库。一种新的基因搜索被认为是由野生型活性在低温转移后诱导的，它使用了吡啶/链球菌/链球菌的阿比丁微调减法方法，但无法获得。