温度感受性ヒトp53癌抑制遺伝子を用いた細胞増殖制御機構の解明

利用温度敏感的人p53抑癌基因阐明细胞增殖控制机制

基本信息

批准号：
07272215
负责人：
土田信夫
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07272215/
关键词：
癌抑制遺伝子 p53 温度感受性変異株 G1停止アポトーシス Rb

项目摘要

p53癌抑制遺伝子の変異は殆ど全てのヒト癌で最も高頻度にみられる。我々は野生型p53のもつ細胞増殖機能に解析するために、ヒトp53の138番目をアラニンからバリンに変えた温度感受性変異株(vall38)を作成し、ラット初代線維芽細胞(REF)、ヒト骨肉腫細胞(Saos-2)、ヒトT細胞白血病(Jurkat)、およびヒト赤白血病細胞(K562)に導入した。これらの細胞を低温シフトしたときの細胞増殖に対する影響を、生細胞数、DNA含量等を基に解析したところ、Jurkat細胞はアポトーシスを他の細胞はG1停止をおこしていた。なおSaos-2細胞ではG2/M停止を起こすものもかなりあった。p53によるG1停止に関してはp21cipl(waf1)の発現誘導、cdk/cyclinの阻害、Rbの脱リン酸化、E2Fとの結合を介するDNA合成開始の阻害が考えられている。G1停止をおこす細胞でp53の下流のシグナル伝達をしらべたところ、K562細胞では上記と一致する。REF細胞ではp21cip1(waf1)の発現誘導を介さない、Rbの発現のないSaos-2細胞ではRbの代わりにp130がG1停止の、シグナル伝達に係わっていることが判明した。そこでREF、Saos-2細胞でのG1停止に、またJurkat細胞でのアポトーシスに関与する遺伝子をクローシングするため、低温シフト前と後それぞれ6時間サイクロヘキシミド存在下で培養し、mRNAを精製後cDNAライブラリーを作成した。低温シフト後に野生型活性によって発現誘導されると思われる新たな遺伝子の検索をピオチン/ストレプトアビジンによるサブトラクション法を用いて試みたが得ることが出来なかった。

p53肿瘤抑制基因中的突变在几乎所有人类癌症中都是最常见的。为了分析野生型p53的细胞增殖功能，我们创建了一个温度敏感的突变体（VALL38），其中人p53的第138位位置从丙氨酸转化为丙氨酸，并引入大鼠原发性成纤维细胞（参考），人类骨细胞（SAOS-2），人类t-Cell Leukemia（人类t-Chunture erukemia（人类）（人类erukemia）（人类erukemia）（人类）（人类erukemia）（人类erkat和人类erkat）和人。（K562）。根据活细胞，DNA含量等分析这些细胞在低温下移动的作用时，Jurkat细胞表明其他细胞患有细胞凋亡，而G1被捕。此外，SAOS-2细胞中有很多情况会导致G2/m停滞。关于p53的G1停滞，人们认为它会诱导P21CIPL（WAF1）的表达，CDK/细胞周期蛋白的抑制作用，RB的去磷酸化以及通过与E2F的结合抑制DNA合成。当在引起G1停滞的细胞中检查p53的信号传导时，上述与K562细胞中的p53进行了检查。发现P130参与了REF细胞中的信号传导中的G1停滞，而在不诱导P21CIP1表达的SAOS-2细胞中（WAF1）中涉及。在不表达RB的SAOS-2细胞中，P130参与G1停滞。因此，为了关闭参与REF和SAOS-2细胞中G1停滞的基因以及Jurkat细胞中的凋亡，在低温转移之前和之后，在存在环己酰亚胺的情况下培养细胞6小时，纯化mRNA并制备cDNA文库。搜索使用Piotin/strettavidin sintraction方法尝试了野生型活性表达的新基因，但无法获得。