中脳・小脳形成における組織間相互作用とIslet-3

中脑和小脑形成中的组织间相互作用和 Islet-3

• 批准号: 09275226
• 负责人: 岡本 仁
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09275226/
• 关键词: LIM; homeodomain蛋白; Islet-3; ゼブラフィッシュ; 小脳; 中脳; 神経分化; dominant negative; homeodomain

LIM/homeodomain型転写転写因子群は、zinc finger様の金属配位部位を持つLIM領域とDNA結合領域のhomeodomainを持つ蛋白の総称である。我々は、LIM/homeodomain蛋白群のうちのIslet-1,Islet-2がその特異的発現パターンから、ゼブラフィッシュ胚の運動神経の特異化と密接に関わっていることを見出した。我々の成果も含め最近のデータは、この遺伝子群が、中枢神経系の部域特異性や、個々の神経細胞の特異性を決定する際に重要な役割を果たすことを強く示唆している。試験管内での機能解析の結果、LIM domainは、通常homedomainのターゲットDNAへの結合を阻害しているが、特定の共役因子がこの部位に結合することにより阻害が解除され、homeodomainのターゲットDNAへの結合が可能となる、というモデルが提唱されている。我々はこのモデルに従い、眼と視蓋に特異的に発現するIslet-3のLIM領域のみをゼブラフィッシュ胚で過剰発現させ、共役因子を吸収することによって内因性Islet-3の機能を抑制する実験を行った。このような胚では、本来Islet-3を特異的に発現する眼と、本来Islet-3を特異的に発現する視蓋に隣接する中脳・後脳境界部の小脳原基のみが欠損するという著しく特異的な異常が観察された。この結果から、中脳視蓋部は中脳・後脳境界部の小脳原基に対して分化を誘導する作用を持っており、Islet-3が眼の分化のみならず、この誘導作用の発現をも制御していることが強く示唆された。我々は更に、逆にIslet-3の活性が人為的に上昇された場合の、中脳及び小脳原基の発達を調べるために以下の実験を行った。まず、LIM領域によるhomeo domainのDNA結合能の阻害を解除するために、LIM領域の金属配位部の構造がアミノ酸置換によって破壊されるように、Islet-3のcDNAに変異を導入した。更に、この変異Islet-3蛋白(Islet-3^<m3>)の活性を任意に制御するために、Islet-3^<m3>のC末端にglucocorticoid受容体のステロイド結合部位を結合させた組換え蛋白(Islet-3^<m3>-GR)をコードする組換え遺伝子を作製した。内因性のIslet-3は、共役因子との結合によって活性化すると考えられるが、Islet-3^<m3>-GRはglucocoidとの結合によって活性化することが期待された。Islet-3^<m3>-GRをコードするmRNAをin vitro転写によって作製し、1細胞期のゼブラフィッシュ受精卵に注入した。受精後12時間後の飼育液にデキサメサゾンを加えることによって、Islet-3^<m3>-GRを活性化させた。このような処理を受けた胚では、中脳・後脳境界領域の前後幅が、正常胚と較べて50〜100%拡大した。この結果は、Islet-3が中脳及と中脳・後脳境界部の間の相互的誘導作用のレベルを調整している可能性を更に支持している。現在このような個体で、中脳及び中脳・小脳境界部の発生に関わる因子群(Pax2,FGF-8,Engrailed,Wntlなど)の発現の変化の詳細を解析中である。

LIM/同源结构域型转录因子群是具有带锌指状金属配位位点的LIM区域和同源结构域DNA结合区域的蛋白质的总称。我们发现 Islet-1 和 Islet-2 是 LIM/同源域蛋白组的成员，根据其特定的表达模式，与斑马鱼胚胎中的运动神经元规范密切相关。最近的数据，包括我们的结果，强烈表明该基因组在确定中枢神经系统的区域特异性和单个神经元的特异性方面发挥着重要作用。体外功能分析的结果显示，LIM结构域通常抑制同源结构域与靶DNA的结合，但当特定的偶联因子与该位点结合时，抑制作用被解除，同源结构域与靶DNA的结合被释放。已经提出了一种模型，其中可以结合根据这个模型，我们在斑马鱼胚胎中仅过度表达了在眼睛和视顶盖中特异性表达的 Islet-3 的 LIM 区域，并进行了通过吸收结合因子来抑制内源性 Islet-3 功能的实验。在这些胚胎中，只有最初特异性表达 Islet-3 的眼睛和最初特异性表达 Islet-3 的位于中脑-后脑边界的小脑原基缺失，最初特异性表达 Islet-3。 。这些结果表明，中脑视顶盖具有诱导中脑/后脑边界的小脑原基分化的作用，并且Islet-3不仅负责眼的分化，而且还强烈负责该诱导作用的表达。建议它还控制我们进一步进行了以下实验来检查当人为增加 Islet-3 活性时中脑和小脑原基的发育。首先，为了消除LIM区域对同源域DNA结合能力的抑制，我们在Islet-3 cDNA中引入突变，使得LIM区域金属配位位点的结构被氨基酸取代破坏。 。此外，为了任意控制这种突变型Islet-3蛋白（Islet-3^<m3>）的活性，我们创建了一个组，其中糖皮质激素受体的类固醇结合位点与Islet-3的C末端结合。构建了编码重组蛋白(Islet-3^<m3>-GR)的重组基因。内源性 Islet-3 被认为是通过与共价因子结合而激活的，但 Islet-3^<m3>-GR 预计是通过与糖皮质激素结合而激活的。通过体外转录生成编码 Islet-3^<m3>-GR 的 mRNA，并将其注射到单细胞阶段受精斑马鱼卵中。受精后12小时，通过向繁殖溶液中添加地塞米松来激活Islet-3^<m3>-GR。在接受这种处理的胚胎中，中脑-后脑边界区域的前后宽度比正常胚胎扩大了50%至100%。这一结果进一步支持了Islet-3调节中脑和中脑-后脑界面之间相互指导水平的可能性。我们目前正在分析这些个体中参与中脑和中脑/小脑边界发育的因子（Pax2、FGF-8、Engrailed、Wntl 等）表达变化的细节。

项目成果

岡本仁: "脳の複雑化と多様化" 現代化学. 11月号. 53-59 (1997)

Hitoshi Okamoto：“大脑的复杂性和多样化”现代化学 11 月号（1997 年）。

Higashijima,S.,Okamoto,H.,Ueno,N.,Hotta,Y.,and Eguchi,G.: "High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using prooter of zebrafish origin." Developmental Biology. 192. 289-299 (1997)

Higashijima,S.、Okamoto,H.、Ueno,N.、Hotta,Y.和Eguchi,G.：“通过使用斑马鱼的启动子，高频生成在整个肌肉或整个身体中可靠表达 GFP 的转基因斑马鱼

Higashijima,S.,Nose,A.,Eguchi,G.,Hotta,Y.,and Okamoto,H.: "Mindin/F-spondin family : novel ECM proteins expressed in the zebrafish embryonic axis." Developmental Biology. 192. 211-227 (1997)

Higashijima,S.、Nose,A.、Eguchi,G.、Hotta,Y. 和 Okamoto,H.：“Mindin/F-spondin 家族：在斑马鱼胚胎轴中表达的新型 ECM 蛋白。”

岡本仁: "LIM/ホメオドメイン型転写因子群" Bio Science用語ライブラリー(脳神経), 164-165 (1997)

Hitoshi Okamoto：“LIM/同源域型转录因子”生物科学术语库（颅神经病学），164-165（1997）

Kikuchi,Y.,Segawa,H.,Tokumoto,M.,Tsubokawa,T.,Hotta,Y.,Uyemura,K.,and Okamoto,H.: "Ocular and cerebellar defects in zebrafish induced by overexpression of the LIM domain of the Islet-3 LIM/homeodomain protein." Neuron. 18. 369-382 (1997)

Kikuchi,Y.、Sekawa,H.、Tokumoto,M.、Tsubokawa,T.、Hotta,Y.、Uyemura,K. 和 Okamoto,H.：“LIM 结构域过度表达引起斑马鱼的眼部和小脑缺陷