イネ・スクロース輸送担体のカエル卵母細胞を用いた機能的発現

利用青蛙卵母细胞表达水稻蔗糖转运蛋白

基本信息

批准号：
09274202
负责人：
鈴木徹
金额：
$ 0.58万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

光合成反応によって固定・生産された炭水化物はスクロースに変換された後、他の器官へ転流される。この際、スクロースは分子量約5万5千の膜タンパクであるスクロース・トランスポーターを介して輸送される。動物においてはグルコースが生体内で植物におけるスクロースの役割を果たしており、細胞膜表面に存在するグルコース輸送担体がスクロース輸送担体と同様の機能を有している。グルコース輸送担体の遺伝子はジーンファミリーを形成し、互いに構造的に類似しているが器官特異的な発現を示す7種類のcDNAが同定されている。スクロース輸送担体についても組織特異的な複数の遺伝子の存在が想定されている。それぞれのcDNAに由来するスクロース輸送担体のV-maxやKm値を特定し、機能より詳細な解析を進めるためには、酵母の発現系では不十分で、動物のグルコース輸送担体の解析において用いられたカエルの卵母細胞の発現系を確立することが重要である。予備実験としてヒトのレニンのcDNAを発現ベクターに組み込み、試験管内でRNAを合成し、カエルの卵巣より摘出したステージVの卵にRNAを微量注入した。その卵から得た膜画分のタンパクをSDSポリアクリルアミドゲルによって電気泳動したところ、予想されるレニンのタンパクに相当する所に顕著なバンドが見出された。さらに、抗レニン抗体を用いて免疫沈降反応を行ったところ、新たに出現したバンドのみが検出された。このことは、微量注入したRNAがカエルの卵母細胞において発現することを示し、この実験系が確立したことを示している。さらに、イネのスクロース由来のcDNAを発現ベクターへ組み込み、RNAの微量注入を試みたが、現在のところ機能的発現には至っていない。

通过光合作用固定和产生的碳水化合物转化为蔗糖，然后转移到其他器官。此时，蔗糖通过蔗糖转运蛋白进行转运，蔗糖转运蛋白是一种分子量约为55,000的膜蛋白。在动物中，葡萄糖起着植物中蔗糖的作用，细胞膜表面存在的葡萄糖转运载体与蔗糖转运载体具有相同的功能。葡萄糖转运蛋白基因形成一个基因家族，并且已鉴定出七种类型的 cDNA，它们在结构上彼此相似，但表现出器官特异性表达。还假设存在蔗糖转运载体的多个组织特异性基因。为了鉴定每个cDNA衍生的蔗糖转运蛋白的V-max和Km值并进行更详细的功能分析，酵母表达系统是不够的，在动物葡萄糖转运蛋白分析中使用的方法建立青蛙卵母细胞表达系统非常重要。作为初步实验，我们将人肾素cDNA插入表达载体，体外合成RNA，并将少量RNA注射到从青蛙卵巢取出的V期卵中。当从鸡蛋中获得的膜组分中的蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳时，在与预测的肾素蛋白相对应的位置处发现了显着的条带。此外，当使用抗肾素抗体进行免疫沉淀反应时，仅检测到新出现的条带。这表明显微注射的RNA在青蛙卵母细胞中表达，表明该实验体系已经建立。此外，我们尝试通过将源自稻蔗糖的cDNA插入到表达载体中来显微注射RNA，但迄今为止尚未实现功能性表达。