平滑筋ミオシン軽鎖リン酸化酵素のアクチン結合と収縮制御

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的肌动蛋白结合和收缩控制

基本信息

批准号：
05256202
负责人：
桑山秀人
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ウシ平滑筋におけるミオシン軽鎖リン酸化酵素(MLCK)として,分子量155kDaおよび130kDaの2種の成分が示された。ミオシン軽鎖のリン酸化活性とアクトミオシンの相互作用を活性化する作用は,2種のMLCKで必ずしも一致しないことから,我々は,分子量の大きい155kDa成分を制御因子(Ln)と考えている。これまで155kDa成分は煩雑な操作により分離されてきたが,今回は20mM MgCl_2による選択的抽出法と中性条件でのQAE-トヨパールカラムクロマトグラフィーを組み合わせる方法が確立され,研究を容易に進めることが可能となった。ウシ平滑筋155kDa成分のN末端はブロックされておりペプチドシーケンサーによる分析結果は得られなかった。一方,130kDa成分については,電気泳動したゲルをニトロセルロース膜に転写した後,膜を切り取り,ペプチドシーケンサーで分析すると,VKPAETPKPL-の配列が得られた。130kDa成分は蛋白分解酵素により155kDa成分のN末端側を切断された分解産物であり,分解で失ったN末端部分がアクトミオシン活性化に重要な機能を担うことを示している。トリ砂嚢MLCKを抗原として作成した単クローン抗体(GK127)は,ウシ平滑筋155kDa成分と免疫交差反応性を示すが,130kDa成分とは反応しないので,GK127を155kDa成分のN末端部分を追跡するプローブとして用いた。ギ酸中で155kDa成分をBrCN分解すると分解断片のうちGK127と反応する成分としては,52kDaペプチドおよび少量の44kDaペプチドが得られた。これらのペプチドは,両者ともにN末端アミノ酸を見いだせないことから155kDa成分のN末端側ペプチド断片と結論された。これらN末端BrCNペプチドは,スピードバックコンセントレータで過剰のBrCNを除いた後,中性条件下,GCL2000をもちいた高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーをおこなうと高収量で調製できた。分離ペプチドは平滑筋アクチンフィラメントと堅く結合した。

牛平滑肌中存在分子量为 155 kDa 和 130 kDa 的肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) 的两种成分。由于两种类型的MLCK中肌球蛋白轻链的磷酸化活性和肌动球蛋白相互作用的激活不一定匹配，因此我们认为大分子量155kDa成分是调节因子（Ln）。迄今为止，155kDa组分的分离都是通过复杂的操作，但这次建立了一种将20mM MgCl_2选择性萃取和中性条件下的QAE-Toyopearl柱色谱相结合的方法，使研究变得更加容易。牛平滑肌155kDa成分的N末端被封闭，无法获得使用肽测序仪的分析结果。另一方面，对于130kDa成分，将电泳凝胶转移至硝酸纤维素膜后，切下膜并用肽测序仪进行分析，得到序列VKPAETPKPL-。 130kDa成分是155kDa成分的N末端侧被蛋白水解酶裂解而得到的降解产物，表明由于降解而丢失的N末端部分在肌动球蛋白活化中发挥重要功能。使用禽砂囊 MLCK 作为抗原制备的单克隆抗体 (GK127) 与牛平滑肌的 155kDa 成分具有免疫交叉反应性，但不与 130kDa 成分发生反应，因此，GK127 可用作追踪 N 的探针。 -155kDa 组分的末端部分。当在甲酸中用BrCN消化155kDa组分时，获得52kDa肽和少量44kDa肽作为与GK127反应的组分。由于在这些肽中均未发现N端氨基酸，因此推断它们是具有155kDa成分的N端肽片段。通过使用 SpeedVac 浓缩器去除过量的 BrCN，然后使用 GCL2000 在中性条件下进行高效液体凝胶过滤色谱，以高产率制备这些 N 末端 BrCN 肽。分离的肽与平滑肌肌动蛋白丝紧密结合。