神経栄養因子欠乏による神経細胞死の機序

神经营养因子缺乏导致神经细胞死亡的机制

基本信息

批准号：
04258216
负责人：
小池達郎
金额：
$ 1.41万
依托单位：
佐賀医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04258216/
关键词：
細胞死神経栄養因子脱リン酸化カスケード

项目摘要

神経細胞は発生過程でその約50%の細胞が脱落する事が知られており、これを自然に起こる神経細胞死と呼んでいる。この神経細胞死は、標的細胞により分泌される神経栄養因子の限定的供給による競合過程の結果であると考える根拠が蓄積されている。特に最近種々の系においてこの細胞死が積極的な過程からなることが示唆され、プログラム神経細胞死として、そのカスケードの解明が重要な課題となっている。ラット新生児上頸神経節神経節細胞を1週間NGF存在化で培養した後、培地中に抗NGF抗体を加えNGFを除去すると、細胞死が起こり、死細胞の割合は2日後には80-90%に達すること、シクロヘキシミド(CHX)やアクチノマイシンD(ACD)により細胞死は阻止されることから最も良いモデルと考えられる。しかし、細胞内カスケードや細胞死関連蛋白質(DAP)を同定、単離するにはもっと多量に試料を調整出来るシステムが望ましい。我々はPC12細胞をNGF処理して分化させるとNGF除去に応答して細胞死が起こることを見いだした。この細胞死はACD、FGF、cAMP、高K+培地で抑えられるが、EGFやTPA等では抑えられないので、血清除去によるPC12細胞死とは異なり、transcription依存的であり、モデルとして有用と考えた。NGF除去により引き起こされる細胞内カスケードを調べる目的で、NGF除去後経時的に細胞を可溶化し、SDS-PAGEを行い、抗phosohotyrosine抗体を用いてWestern Blottingを行うと、p120,p90,p73,p53の主要なチロシンリン酸化蛋白質に脱リン酸化が起こることが判った。NGFを加えた時に顕著に活性化されることが知られているMAPKp44、p42活性は低く、このカスケードは関与していないと思われる。一方SDS-PAGE後の転写膜を用いてkinase活性をrenaturationする方法で自己リン酸化能を調べると、NGF除去に伴って主要なリン酸化活性(Ser/Thr)が徐々に減少することが判った。これらの脱リン酸化カスケードが直接細胞死を導くのか不明であるが、この脱リン酸化反応経過はCHXやACD処理で遅れることから、なんらかの制御された過程であると考えられる。

据了解，大约50%的神经细胞在发育过程中脱落，这称为自然神经细胞死亡。越来越多的证据表明，这种神经元细胞死亡是由于靶细胞分泌的神经营养因子供应有限而导致的竞争过程的结果。特别是，最近有人提出，这种细胞死亡由各个系统中的活跃过程组成，并且阐明程序性神经元细胞死亡的级联已成为一个重要问题。将新生大鼠颈上神经节细胞在NGF存在下培养1周后，在培养基中添加抗NGF抗体并去除NGF导致细胞死亡，2天后死亡细胞百分比降至80-90%。放线菌酮（CHX）和放线菌素D（ACD）可以防止细胞死亡，因此被认为是最好的模型。然而，为了识别和分离细胞内级联和死亡相关蛋白（DAP），需要一个可以制备大量样品的系统。我们发现，当 PC12 细胞通过 NGF 处理分化时，细胞死亡是由于 NGF 去除而发生的。这种细胞死亡可以被 ACD、FGF、cAMP 和高 K+ 培养基抑制，但不能被 EGF 或 TPA 抑制，因此与血清去除引起的 PC12 细胞死亡不同，它是转录依赖性的，被认为可作为模型。为了研究 NGF 去除引起的细胞内级联反应，我们在 NGF 去除后随时间溶解细胞，进行 SDS-PAGE，并使用抗磷酸酪氨酸抗体进行蛋白质印迹，发现主要的酪氨酸磷酸化蛋白发生去磷酸化。。已知当添加 NGF 时 MAPKp44 和 p42 活性会显着激活，但它们的活性较低，并且该级联似乎不参与其中。另一方面，当我们在 SDS-PAGE 后使用转移膜复性激酶活性来检查自磷酸化能力时，我们发现随着 NGF 的去除，主要磷酸化活性（Ser/Thr）逐渐降低。目前尚不清楚这些去磷酸化级联是否直接导致细胞死亡，但由于 CHX 或 ACD 治疗延迟了这种去磷酸化反应的进程，因此它被认为是某种调节过程。