ゲノム・エピゲノム編集をもちいたダウン症候群の知的障害に対する遺伝子治療法開発

利用基因组/表观基因组编辑开发针对唐氏综合症相关智力障碍的基因疗法

• 批准号: 22H03039
• 负责人: 北畠 康司
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2027-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03039/
• 关键词: ダウン症候群; 遺伝子治療; ゲノム編集; 知的障害; エピジェネティック編集; iPS細胞

ダウン症候群は21番染色体のトリソミーによって引き起こされる代表的な遺伝性疾患である。申請者らはこれまで、疾患特異的iPS細胞とゲノム編集技術を組み合わせダウン症の中枢神経病態の解析を行ってきた。健常アストロサイトは本来、神経細胞への保護作用をもっており、両者を共培養すると神経細胞のアポトーシスが抑制されるが、ダウン症アストロサイトではこの保護作用が消失するばかりか、神経細胞に過剰なアポトーシスを誘導してしまう。ダウン症アストロサイトでは自然免疫の重要な鍵を握る“NLRP3インフラマソーム”の活性が著しく上昇していること、さらにその責任遺伝子として、21番染色体上のDYRK1A を同定することに成功した。そこで本研究課題ではこのDYRK1Aに注目し、ゲノム編集・エピジェネティック編集をもちいることでその発現量を抑制することによる治療法開発を目指している。真下らによって開発された新しいゲノム編集技術であるCRISPR-Cas3は、数塩基の切断しか行わないCas9とは異なり、最大数十kbもの大規模な塩基欠失を引き起こすという大きな特徴をもち、またオフターゲット効果がCRISPR-Cas9と比較して低い。そこでDYRK1Aの3アレルのうちの1つだけがもつSNPと組み合わせてCRISPR-Cas3を作用させることで、DYRK1Aの正確なコピー数補正を試みた。また、切断活性を失くしたdead Cas9 (dCas9)に転写制御因子やヒストン修飾酵素を融合させ、DNAメチル化を変化させることで標的領域の遺伝子発現を自由に制御することのできるエピジェネティック編集を用いて、DYRK1Aの発現制御を試みた。その結果、in vitroにおいていずれもDYRK1Aの発現量低下を確認することができた。

唐氏综合症是由21号染色体三体引起的典型遗传病。申请人迄今已通过结合疾病特异性iPS细胞和基因组编辑技术分析了唐氏综合症的中枢神经系统病理学。健康的星形胶质细胞本来对神经元有保护作用，当它们共培养时，神经元凋亡受到抑制，但在唐氏综合症星形胶质细胞中，这种保护作用不仅被废除，而且神经元会发生过度凋亡。他们发现，在先天免疫中发挥重要作用的NLRP3炎症小体的活性在唐氏综合症星形胶质细胞中显着增加，并且还成功地鉴定出21号染色体上的DYRK1A是对此负责的基因。因此，本研究项目重点关注DYRK1A，旨在通过基因组编辑和表观遗传编辑抑制其表达水平来开发治疗方法。 CRISPR-Cas3是Mashita等人开发的一种新型基因组编辑技术，其主要特点是会造成高达数十千碱基的大规模缺失，而Cas9则只剪切几个碱基，与CRISPR相比，靶向效果较低。 -Cas9。因此，我们尝试通过使用CRISPR-Cas3与DYRK1A的三个等位基因之一仅具有的SNP相结合来精确校正DYRK1A的拷贝数。此外，通过将转录调节剂和组蛋白修饰酶融合到失去切割活性的死亡Cas9（dCas9）上，我们尝试通过改变DNA甲基化来自由控制目标区域的基因表达，从而实现表观遗传编辑。使用此方法的 DYRK1A。结果，我们能够在体外确认 DYRK1A 表达水平的降低。