Comprehensive elucidation of the mechanisms of circulating microRNA variability during pancreatic carcinogenesis

全面阐明胰腺癌发生过程中循环microRNA变异的机制

基本信息

批准号：
22H02927
负责人：
松崎潤太郎
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02927/
关键词：
マイクロRNA 膵臓がん CRISPR/Cas9 膵がん細胞外小胞

项目摘要

膵がんのように早期診断技術開発が待望される腫瘍において、血中マイクロRNA (miRNA)診断の実用化が期待されている。多くの臨床検体の解析から、そのコンセプトの正しさは実証されているが、血中miRNAによってなぜ膵がんが診断できるのか、正確には証明しきれていない。特に膵がん発がん過程において、KRASを筆頭としたドライバー遺伝子変異の蓄積のどの段階で血中miRNAプロファイルが変化するのかは不明である。加えて、膵腫瘍の発生によって周辺の細胞や免疫細胞などが反応し、分泌するmiRNAが変化することも、血中miRNAに大きく影響している可能性がある。本研究はこれらの点を考慮し、マウスで膵発がん過程での血中miRNA変化を追跡し、その意味を理解することを目的とする。まずマウス膵管初代培養より樹立した膵前駆細胞に対し、CRISPR/Cas9を用いて遺伝子編集を行い、KRAS、CDKN2A、TP53、SMAD4の変異を導入した膵多段階発がん細胞株系列を作成した。各細胞の培養上清より細胞外小胞を収集し、miRNA-seqによってmiRNAプロファイルを網羅的に解析した。これにより、各ドライバー遺伝子変異に固有のmiRNA分泌パターンの変化を見出した。さらに当該細胞株にそれぞれLuciferaseを導入した後、免疫不全マウス(ヌードマウス)の膵臓内に移植し、各遺伝子変異が細胞増殖や生命予後に与える影響をin vivoで明確にした。

血液微小RNA（miRNA）诊断的实际应用有望应用于胰腺癌等肿瘤早期诊断技术的发展。尽管这一概念的有效性已通过许多临床样本的分析得到证明，但尚未确切证明为什么可以利用血液中的miRNA来诊断胰腺癌。特别是，在胰腺癌的癌变过程中，包括KRAS在内的驱动基因突变积累期间，血液miRNA谱发生变化的阶段尚不清楚。此外，胰腺肿瘤的发生可能会引起周围细胞和免疫细胞发生反应，导致分泌的miRNA发生变化，这可能对血液miRNA产生显着影响。考虑到这些点，本研究旨在追踪小鼠胰腺癌发生过程中血液miRNA的变化并了解其意义。首先，使用 CRISPR/Cas9 对从小鼠胰管原代培养物中建立的胰腺祖细胞进行基因编辑，以创建引入 KRAS、CDKN2A、TP53 和 SMAD4 突变的多阶段胰腺致癌细胞系。从每个细胞的培养上清液中收集细胞外囊泡，并使用 miRNA-seq 综合分析 miRNA 谱。通过这一点，我们发现了每个驱动基因突变特有的 miRNA 分泌模式的变化。此外，将荧光素酶引入每个细胞系后，将它们移植到免疫缺陷小鼠（裸鼠）的胰腺中，以阐明每个基因突变对体内细胞增殖和生命预后的影响。