Development of Mitochondrial Disease Therapy by Mitochondrial DNA Replacement in Hematopoietic Stem Cells

造血干细胞线粒体 DNA 置换治疗线粒体疾病的进展

• 批准号: 22H02851
• 负责人: 五條 理志
• 金额: $ 11.07万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02851/
• 关键词: ミトコンドリア; ミトコンドリア病; ミトコンドリアゲノム異常; ミトコンドリア置換; 骨髄移植; ミトコンドリアゲノム置換; mRNA transfection; Single cell ddPCR; Mitochondrial DNA; MirC; 血液幹細胞; 血液幹細胞移植

mRNA gene transfectionは、Nucleotideの改変、in vitro transcriptionで作成されたmRNAの精製、Transfection法の検討を行った。mRNA Therapeuticsの発展を踏襲し、Pseudouridineの使用とHPLCによる精製を加えることで、従来の方法で認められたIL-1, IL-6, TNF-αなどの炎症性サイトカインの分泌が抑制された。また、Transfectionは、NucleofectorからCAR-T療法でmRNA transfectionにおいてInnate immunityを抑制していると報告のあるMaxCyte社製Electroporatorへの変更による有意な変化を認めることはできず、Nucleofectorを用いた遺伝子導入を基本プロトコールとすることとした。対象細胞はPeliminaryではc-kit+細胞を用いてNZBマウスを用いて置換されたmtDNAの生着をconventional SNP TaqMan qPCR assay及びsc-ddPCR Heteroplasmy assayで確認したところ、ミトコンドリア共培養から1週間ではドナーゲノタイプが50%を越えており、完全置換された細胞も確認された。遺伝子発現変化をRNA seqを用いて解析した結果は、ミトコンドリア呼吸能に関する発現に変化を認めた。移植実験は現在も進行中であるが、血液系の再構築を行った後に、ドナー由来血液系細胞は置換されたミトコンドリアゲノタイプを維持していることが確認された。このミトコンドリアゲノムの安定性の評価及び、その表現系の変化を2年目の検討課題とする。加えて、置換されたミトコンドリアゲノタイプがホスト細胞にいこうしていることが認められ、その移行メカニズムの検討も今後の課題としたい。

对于mRNA基因转染，我们修饰了核苷酸，纯化了体外转录产生的mRNA，并检查了转染方法。随着 mRNA 疗法的发展，假尿苷和 HPLC 纯化的使用抑制了炎症细胞因子的分泌，如 IL-1、IL-6 和 TNF-α，这是使用常规方法观察到的。此外，关于转染，由于从 Nucleofector 更改为 MaxCyte 制造的 Electroporator，我们无法观察到任何显着变化，据报道，使用 CAR-T 疗法可以抑制 mRNA 转染中的先天免疫。 Peliminary中使用的靶细胞为c-kit+细胞，使用NZB小鼠，通过常规SNP TaqMan qPCR检测和sc-ddPCR异质性检测确认替换的mtDNA的植入超过50%，并且某些细胞也被证实具有超过50%。被完全取代。使用 RNA seq 分析基因表达变化揭示了与线粒体呼吸能力相关的表达变化。尽管移植实验仍在进行中，但已证实供体来源的血细胞在血液系统重建后仍保持被替换的线粒体基因型。评估线粒体基因组的稳定性及其表达系统的变化将是第二年的研究主题。此外，还观察到被替换的线粒体基因型被转移到宿主细胞中，我们希望研究这种转移的机制作为未来的课题。

项目成果

Mitochondrial DNA replaced human CD34+ cells showed SCID-repopulating cell activity and transfer human mitochondria to NOD/SCID mice tissues

线粒体 DNA 替换人 CD34 细胞显示 SCID 重建细胞活性并将人线粒体转移至 NOD/SCID 小鼠组织

• 发表时间: 2022
• 作者: Amnon Peled;Michal Abraham;Inbal Mishalian;Devorah Olam;Yosuke Suzuki;Daisuke Kami;Hideki Maeda;Ryotaro Maeda;Dori Pelled;Silvia Noiman;and Satoshi Gojo
• 通讯作者: and Satoshi Gojo

Mitochondrial DNA-replaced Hematopoietic Progenitor Cells

线粒体 DNA 替代造血祖细胞

• 发表时间: 2023
• 作者: 鈴木陽介;上大介;田谷俊彦;五條理志
• 通讯作者: 五條理志

ミトコンドリアDNA置換によるミトコンドリア病治療法の開発

通过线粒体 DNA 替代开发线粒体疾病治疗方法

• 发表时间: 2023
• 期刊: 実験医学
• 作者: Omatsu Yoshiki;Aiba Shota;Maeta Tomonori;Higaki Kei;Aoki Kazunari;Watanabe Hitomi;Kondoh Gen;Nishimura Riko;Takeda Shu;Chung Ung-il;Nagasawa Takashi;榎本篤;尾松芳樹;榎本篤;榎本篤;尾松芳樹;五條理志
• 通讯作者: 五條理志

体細胞におけるミトコンドリアゲノム置換技術

体细胞线粒体基因组替换技术

• 发表时间: 2023
• 作者: 五條理志;上大介;前田英貴;前田遼太朗;鈴木陽介;田谷俊彦;Dori Pelled;Silvia Noiman;稲葉太郎
• 通讯作者: 稲葉太郎

MtDNA-replaced hematopoietic stem/progenitor cells (LSK cells) treatment to a mouse model of heteroplasm

MtDNA 替代造血干/祖细胞（LSK 细胞）治疗异质性小鼠模型

• 发表时间: 2022
• 作者: Amnon Peled;Yosuke Suzuki;Daisuke Kami;Hideki Maeda;Ryotaro Maeda;Marie-Lune Simard;Dori Pelled;Silvia Noiman;and Satoshi Gojo
• 通讯作者: and Satoshi Gojo