Collective mechanics and regulation of mitotic kinesins for spindle assembly

纺锤体组装有丝分裂驱动蛋白的集体力学和调节

• 批准号: 22H02590
• 负责人: 島本 勇太
• 金额: $ 11.07万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02590/
• 关键词: 細胞分裂; 紡錘体; 微小管; キネシン; 一分子計測; 有志分裂; 分子モーター; キネシン結合因子; インビトロ再構成; 細胞分裂; 紡錘体; 微小管; キネシン; 一分子計測; 有志分裂; 分子モーター; キネシン結合因子; インビトロ再構成

紡錘体は微小管を基礎に分裂期の細胞内に一過形成される染色体分配装置であり、その構造破綻は染色体分配エラーを通してがんや不妊症と密接に関係する。本研究ではこの紡錘体形成の分子機構を明らかにするため、特に有糸分裂期に活性化される数種のキネシンとその制御因子TPXの相互作用に着眼し、インビトロ再構成の手法を使って機能解析を行った。当該年度は、当初計画に従って、HEK293細胞を利用したTPX2の発現精製系を確立した。TPX2は仮説の検証に必要な数種類を準備した。また共同研究者と共に別の制御因子の発現精製も進めた。準備したコンストラクトを使用して、TPX2の微小管上での結合動態、運動能、隣接微小管の架橋特性等の解析を蛍光一分子イメージング顕微鏡を使って実現した。微小管架橋特性の解析については、その極性を高信頼で決定可能な手法を確立した。さらにTPX2存在化で４量体キネシンの一種であるEg5の微小管上でのATP依存的運動と微小管の架橋特性を詳細に可視化解析できる実験システムを構築し、未同定の機能を発見した。またこれとは独立に高速原子間力顕微鏡や電子顕微鏡を使った超分子構造の解析も進め、キネシン制御因子が示す非構造性ダイナミクスや微小管上での複合体形成能について新たな洞察を得た。これと並行して、次年度以降の目標である他種の４量体キネシンの解析準備を研究分担者と協力して進め、発現精製系の立ち上げと精製サンプルの活性評価を行った。

纺锤体是一种染色体分配装置，根据微管的基础，在有丝分裂阶段在细胞内转产，其结构衰竭与通过染色体分布误差与癌症和不育密切相关。在这项研究中，我们专注于在有丝分裂阶段激活的几种驱动蛋白及其调节因子TPX之间的相互作用，并使用体外重建技术进行了功能分析。在今年，根据初始计划建立了使用HEK293细胞进行TPX2表达的纯化系统。我们已经准备了几种类型的TPX2来验证该假设。此外，共同研究者还进行了另一个调节因素的表达纯化。使用准备好的构建体，使用单分子荧光成像显微镜来实现TPX2结合动力学，运动性和相邻微管的交联性的分析。为了分析微管交联属性，已经建立了一种方法，可以可靠地确定极性。此外，通过TPX2的存在，我们构建了一个实验系统，该系统允许详细可视化ATP依赖性运动和EG5微管的交联特性，EG5（一种四聚体驱动蛋白），并发现了一个未识别的功能。此外，我们还使用高速原子显微镜和电子显微镜对超分子结构进行了分析，并获得了对驱动蛋白调节剂表现出的非结构动力学的新见解，并能够在微管上形成复合物。同时，我们与研究人员合作，为对其他四聚体驱动蛋白的分析做准备，这是我们与研究人员合作的下一个财政年度及以后的我们的目标，并启动了纯化系统，并评估了纯化样品的活性。