シアノバクテリア光センサーのプロトン化状態の解明に資する構造基盤

有助于阐明蓝藻光学传感器质子化状态的结构基础

• 批准号: 22H02562
• 负责人: 三島 正規
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02562/
• 关键词: プロトン化状態; NMR; 結晶構造解析; シアノバクテリオクロム; X線結晶構造解析; RcaE; 光センサータンパク質

RcaEタンパク質は、緑色・赤色光照射によって２つの安定な緑色光吸収型と赤色光吸収型の間を構造変換（光変換）する。その構造変化は、リンカー領域を経てキナーゼドメインに伝わり標的タンパク質をリン酸化することでシグナルが伝達される。申請者らは、X線結晶構造解析、NMR解析等から、赤色光吸収型の立体構造と光変換による発色団のプロトン化・脱プロトン化を構造レベルで明らかにしている。本研究では、さらに、緑色光吸収型の立体構造や発色団まわりのタンパク質側のプロトン化状態を明らかにし、光変換のメカニズムを解明することを目的に研究に取り組んだ。代表者の三島と分担者の永江により、緑色光吸収型での高分解能のX線結晶構造解析を目指して、種々のコンストラクトを作成し、結晶化を行った。機能に重要なS2-S3ループの柔軟性が結晶化を阻害していると推定され、結晶が成長しない可能性も十分考えられたことから、より長い領域での（むしろ全長に近い長さ）のコンストラクトの方が結晶化に適する可能性も考え 、結晶化に適すると想定される領域のコンストラクトを設計し、結晶化サンプルを調製した。結果として、以前、赤色光吸収型でX線結晶構造解析に成功していた発色団を含むGAFドメインの領域を、さらにN末端側に伸ばしたコンストラクトで、結晶化、結晶構造解析に成功した。また発色団のPCBが脱プロトン化する部位として、NMRのスペクトル計算からB環と考えているが、脱プロトン化部位がどこであるか、実験的に決着をつけるためPCBのNMR信号の完全帰属を行う必要があり、この帰属には環特異的安定同位体標識PCBの合成が必要である。この合成は分担者の宇梶が担当し、微量であるが、環特異的安定同位体標識PCBの調製に成功した。分担者の広瀬はアポ体で調製したRcaEのGAFドメインにPCBを取り込ませ、測定試料を調製する工程の最適化を行った。

RCAE蛋白通过绿色和红光照射在两种稳定的绿色和红光吸收类型之间转化结构（光）。结构变化通过接头区域传输到激酶结构域，该信号通过靶蛋白的磷酸化传播。申请人在结构层面上澄清了通过X射线晶体结构分析和NMR分析等通过光转化来对发色团的质子化和去质子化。代表Mishima和Sharer Nagae创建了各种构造，并以高分辨率的X射线晶体学分析对绿光吸收类型进行了结晶。据推测，S2-S3环的灵活性对其功能很重要，抑制了结晶，并且很好地认为，结晶不会增长的可能性，因此我们还认为，在更长的区域（或更接近全长）中构造的可能性更适合于结晶的区域，并适用于结晶的结晶，并适合于结晶的区域。结果，以前已通过红光吸收类型成功分析了包含发色团的GAF结构域的区域，进一步扩展到N末端，以使结晶和晶体结构分析成功。此外，我们将B环视为从NMR光谱计算中质子化发色团PCB的位置，但是为了确定去质子化位点位于何处，有必要完全分配PCB NMR信号，对于此分配，必需的同位素同位素稳定的PCB是必不可少的。该合成由共享者Ukaji处理，尽管在痕量量中，环形特异性稳定同位素标记的PCB的准备还是成功的。共享者Hirose的PCB将PCB掺入了Apo-Form制备的RCAE的GAF结构域中，并优化了准备测量样品的过程。

项目成果

シアノバクテリアの光センサーにおける脱プロトン化した塩基性アミノ酸の観測

蓝藻光电传感器中去质子化碱性氨基酸的观察

• 发表时间: 2022
• 作者: 尾嶋拓;杉田有治;Cheng Tan;Yutaka Ito;Yutaka Ito;伊藤 隆;Yutaka Ito;永江 峰幸，飯塚 佑介，青山 洋史，宮ノ入 洋平，神野 智司，伊藤 隆，広瀬 侑，三島 正規
• 通讯作者: 永江 峰幸，飯塚 佑介，青山 洋史，宮ノ入 洋平，神野 智司，伊藤 隆，広瀬 侑，三島 正規

光遺伝学を指向したシアノバクテリオクロムの構造基盤

蓝藻色素光遗传学的结构基础

• 发表时间: 2023
• 作者: 永江 峰幸;飯塚 佑介;青山 洋史;宮ノ入 洋平;神野 智司;伊藤 隆;広瀬 侑;三島 正規
• 通讯作者: 三島 正規

リジンはいつもプラスとは限らない。我々は本当にタンパク質を見たか？

赖氨酸并不总是一个优点。

• 发表时间: 2023
• 作者: 安達 友里子;金子 美華;加藤 幸成;禾 晃和;Shintomi Keishi;三島正規
• 通讯作者: 三島正規

X-ray crystallographic study and NMR analyses of protonation state of chromophore of cyanobacterial photoreceptor protein

蓝藻感光蛋白发色团质子化状态的X射线晶体学研究和核磁共振分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 飯塚 佑介;永江 峰幸;青山 洋史;伊集院 良祐;伊藤 隆;広瀬 侑;三島 正規
• 通讯作者: 三島 正規

15N NMRによるシアノバクテリオクロムのプロトン化状態の解析

15N NMR 分析蓝细菌色素的质子化态

• 发表时间: 2022
• 期刊: 日本核磁気共鳴学会機関誌
• 作者: 永江 峰幸;青山 洋史;三島 正規
• 通讯作者: 三島 正規