The study of X chromosome inactivation maintenance in primate.

灵长类X染色体失活维持的研究。

基本信息

批准号：
22H02539
负责人：
岡本郁弘
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02539/
关键词：
X染色体の不活性化霊長類カニクイザル XIST SmcHD1

项目摘要

本研究では、(1) カニクイザル初代培養体細胞を利用して、霊長類のXCI維持機構を解明し、次いで, (2)カニクイザル着床後胚を用いて、XCI確立から維持に至る経路を明らかにする研究を行う。本年度はCRISPR/Cas9システムを用いてXIST KO（プロモーター欠損）初代培養体細胞を作製し、これら細胞において不活性X染色体に特異的なヒストン修飾を蛍光免疫染色で解析し、XIST及びX連鎖遺伝子の発現をRNA FISH を用いてXIST KO体細胞のおけるX連鎖遺伝子の再活性化状態を解析し、XISTのXCI維持における必要性を検討した。その結果、不活性X染色体に特異的ヒストン修飾はH3K9me3以外は全て消失し、不活性化維持に必要であると報告されているSmcHD1の蓄積は維持されてていたが、X連鎖遺伝子の発現は認められなかった。これらの結果から、XISTは体細胞の不活性化X染色体の特異的ヒストン修飾維持に必要であるが、X連鎖遺伝子の発現抑制維持には必要ない事を明らかにした。さらに、XCI維持へのSmcHD1の機能を解析するために、XIST KO 体細胞のSmcHD1 をさらにKOし、同様の解析を行なった。XIST KO ＋SmcHD1 KO細胞で、SmcHD1の消失は確認できたが、不活性XからのX連鎖遺伝子の再発現は認めらなかった。この結果から、SmcHD１もX連鎖遺伝子の発現抑制維持には必要ない事を明らかにした。

在本研究中，我们将（1）利用食蟹猴原代培养体细胞阐明灵长类动物中XCI的维持机制，以及（2）利用食蟹猴植入后胚胎阐明XCI从建立到维持的途径进行研究。到今年，我们使用 CRISPR/Cas9 系统创建了 XIST KO（启动子缺陷）原代培养体细胞，使用荧光免疫染色分析了这些细胞中失活 X 染色体特异的组蛋白修饰，并研究了 XIST 和 X 连锁的影响我们使用 RNA FISH 分析了 XIST KO 体细胞中 X 连锁基因的重新激活状态，并研究了 XIST 在维持 XCI 中的必要性。结果，除了H3K9me3之外，所有针对失活X染色体特异的组蛋白修饰都消失了，并且据报道对于维持失活所必需的SmcHD1的积累得以维持，但X连锁基因的表达却未被识别。。这些结果表明，XIST 需要维持体细胞中失活 X 染色体上的特定组蛋白修饰，但不需要维持 X 连锁基因的抑制表达。此外，为了分析SmcHD1在维持XCI中的功能，我们进一步敲除XIST KO体细胞中的SmcHD1并进行类似的分析。尽管在 XIST KO + SmcHD1 KO 细胞中证实了 SmcHD1 的消失，但未观察到来自失活 X 的 X 连锁基因的重新表达。这些结果表明，SmcHD1 也不需要维持 X 连锁基因的抑制表达。