狙ったDNAが過剰メチル化された疾患モデル動物作製法の開発

开发一种创建目标 DNA 高甲基化疾病模型动物的方法

基本信息

批准号：
22H02537
负责人：
堀居拓郎
金额：
$ 8.74万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02537/
关键词：
エピゲノム編集メチル化 DNAメチル化 dCas9 プラダー・ウィリー症候群

项目摘要

DNAメチル化をはじめとするエピジェネティック修飾は、遺伝子発現や染色体構造を制御し、その破綻は様々な疾病を引き起こすと考えられる。これまでに我々は高効率エピゲノム編集法を開発し（Nat Biotechnol 2016）、標的領域のDNA脱メチル化により、インプリンティング疾患であるシルバー・ラッセル症候群のエピゲノム編集モデルマウスの作製に成功した（Genome Biol 2020）。一方、DNAの過剰メチル化による疾患モデル動物の報告はまだない。その原因として、導入したDNAの過剰メチル化状態を個体で維持することが難しい点が挙げられる。令和4年度は、DNAメチル基転移酵素であるDnmt3aやDnmt3bに加え、補因子であるDnmt3lやKRABなどをマウス初期胚で共発現することにより、安定したメチル化編集法を確立することを試みた。Dnmt3aまたはDnmt3b単独による過剰メチル化導入では、数日でメチル化状態が元に戻ってしまうことから、補因子であるDnmt3lやKRABの共発現によりエピゲノム編集状態が長期間維持されるのか検討した。過剰メチル化の標的として、PWSの原因領域と考えられているSnrpn-DMRを選択した。マウスES細胞に、エピゲノム編集の最小単位であるdCas9-SunTagとscFv-Dnmt3b、Snrpn-DMRに対するgRNA（６種類）の発現ベクターに加え、Dnmt3lおよびKRAB強制発現ベクターをトランスフェクションし共発現させた。１ヶ月間継代培養したところ、Dnmt3bとKRABを組み合わせた場合に、最も安定的にDNAメチル化が維持された。Dnmt3b単独またはKRAB単独では十分なメチル化導入と維持を行うことができなかった。一方、Dnmt3lはDNAメチル化の長期維持に必ずしも必要な因子ではなかった。

DNA甲基化等表观遗传修饰控制基因表达和染色体结构，这些修饰的破坏被认为会导致各种疾病。迄今为止，我们已经开发出一种高效的表观基因组编辑方法（Nat Biotechnol 2016），并通过目标区域的DNA去甲基化成功创建了针对印记疾病Silver-Russell综合征的表观基因组编辑模型小鼠（Genome Biotechnol 2020）。）。另一方面，目前还没有关于DNA高甲基化引起的疾病的动物模型的报道。原因之一是很难在个体中维持引入的 DNA 的高甲基化状态。 2020财年，我们将尝试通过在早期小鼠胚胎中共表达DNA甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b以及辅因子Dnmt3l和KRAB来建立稳定的甲基化编辑方法。由于单独由 Dnmt3a 或 Dnmt3b 诱导的高甲基化会在几天内将甲基化状态恢复到原始状态，因此我们研究了是否可以通过共表达辅助因子 Dnmt3l 和 KRAB 来长期维持表观基因组编辑状态。作为高甲基化的靶点，我们选择了 Snrpn-DMR，它被认为是 PWS 的致病区域。将表观基因组编辑最小单位dCas9-SunTag的表达载体、Snrpn-DMR的scFv-Dnmt3b和gRNA（6种）以及Dnmt3l和KRAB的强制表达载体转染小鼠ES细胞，并共表达。当传代培养1个月时，当Dnmt3b和KRAB组合时，DNA甲基化保持最稳定。单独的 Dnmt3b 或单独的 KRAB 无法引入并维持足够的甲基化。另一方面，Dnmt3l不一定是长期维持DNA甲基化所需的因子。