狙ったDNAが過剰メチル化された疾患モデル動物作製法の開発

开发一种创建目标 DNA 高甲基化疾病模型动物的方法

基本信息

批准号：
22H02537
负责人：
堀居拓郎
金额：
$ 8.74万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02537/
关键词：
エピゲノム編集メチル化 DNAメチル化 dCas9 プラダー・ウィリー症候群

项目摘要

DNAメチル化をはじめとするエピジェネティック修飾は、遺伝子発現や染色体構造を制御し、その破綻は様々な疾病を引き起こすと考えられる。これまでに我々は高効率エピゲノム編集法を開発し（Nat Biotechnol 2016）、標的領域のDNA脱メチル化により、インプリンティング疾患であるシルバー・ラッセル症候群のエピゲノム編集モデルマウスの作製に成功した（Genome Biol 2020）。一方、DNAの過剰メチル化による疾患モデル動物の報告はまだない。その原因として、導入したDNAの過剰メチル化状態を個体で維持することが難しい点が挙げられる。令和4年度は、DNAメチル基転移酵素であるDnmt3aやDnmt3bに加え、補因子であるDnmt3lやKRABなどをマウス初期胚で共発現することにより、安定したメチル化編集法を確立することを試みた。Dnmt3aまたはDnmt3b単独による過剰メチル化導入では、数日でメチル化状態が元に戻ってしまうことから、補因子であるDnmt3lやKRABの共発現によりエピゲノム編集状態が長期間維持されるのか検討した。過剰メチル化の標的として、PWSの原因領域と考えられているSnrpn-DMRを選択した。マウスES細胞に、エピゲノム編集の最小単位であるdCas9-SunTagとscFv-Dnmt3b、Snrpn-DMRに対するgRNA（６種類）の発現ベクターに加え、Dnmt3lおよびKRAB強制発現ベクターをトランスフェクションし共発現させた。１ヶ月間継代培養したところ、Dnmt3bとKRABを組み合わせた場合に、最も安定的にDNAメチル化が維持された。Dnmt3b単独またはKRAB単独では十分なメチル化導入と維持を行うことができなかった。一方、Dnmt3lはDNAメチル化の長期維持に必ずしも必要な因子ではなかった。

表观遗传修饰，包括DNA甲基化，调节基因表达和染色体结构，其失败被认为会导致多种疾病。迄今为止，我们已经开发了一种高效的表观基因组编辑方法（NAT Biotechnol 2016），并通过目标区域的DNA脱甲基化成功地创建了一种用于印迹疾病银罗素综合征（Genome Biol 2020）的表观基因组编辑模型。另一方面，由于DNA高甲基化，尚未对疾病模型动物的报道。这样做的原因之一是，很难维持个人中引入的DNA的过度甲基化。在2022年，我们试图通过共表达辅助因子（例如DNMT3L和KRAB）在早期小鼠胚胎中建立稳定的甲基化编辑方法，此外除了DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B外，还建立了辅助方法。在仅使用DNMT3A或DNMT3B引入过度甲基化的情况下，甲基化状态在几天内恢复正常，因此我们研究了辅助因子DNMT3L和KRAB的共表达是否长期保持表观遗传组编辑状态。被认为是PWS的致病区域的SNRPN-DMR被选为高甲基化的靶标。将小鼠ES细胞转染并与DCAS9-Suntag，SCFV-DNMT3B和SNRPN-DMR的GRNA的表达矢量（6种类型）共表达，它们是表观基因组编辑的最小单元，以及DNMT3L和KRAB强制性表达量。亚文化1个月显示，当将DNMT3B和KRAB合并时，DNA甲基化最稳定。单独使用DNMT3B或单独使用KRAB不能提供足够的甲基化引入和维护。另一方面，DNMT3L不一定是长期维持DNA甲基化的必要因素。