iPS細胞を用いた腱・靭帯細胞への分化誘導系の確立

使用iPS细胞建立肌腱/韧带细胞分化诱导系统

• 批准号: 26893164
• 负责人: 吉本 由紀
• 金额: $ 0.92万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-08-29 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26893164/
• 关键词: Scleraxis; iPS細胞; 腱; 靭帯; Tnmd

初期化遺伝子を体細胞に発現させるためにウイルスベクターを導入すると、作成したiPS細胞のゲノムに変異が生じることが問題になっている。そこで、初期化遺伝子を発現させるベクターとして、導入細胞のゲノムに挿入されないエピソーマルベクターを選択した。エピソーマルベクターによるマウスiPS細胞株の樹立はこれまでに報告がないため、効率良く樹立するための条件検討を行った。異なった発生段階にあるマウス胎仔 (胎生12日～14日齢)から細胞分離を行って比較検討し、胎生14.5日胚から生存率が高く増殖性を維持したMEFを分離する最適条件を確定した。次に、ScxGFPマウスの由来のMEFにOCT3/4, SOX2, KLF-4, c-MYC, LIN28, NANOG, EBNA1の遺伝子とp53に対するshRNAが挿入された4種類のエピソーマルベクターをエレクトロポレーションにより導入した。継代を行わず、15%の血清添加ES細胞用培地中で4週間培養を行った結果、iPS細胞様の形態を示すコロニーが複数得られた。また、TnmdCreノックインマウスとレポーターマウスを用いたレポーター発現解析の結果、Tnmdの発現領域でTomatoを検出するには、ゲノムに挿入されるトランスジーンが１コピーでは不十分であることが判明した。従って、TnmdTomatoマウスの作成には、Bacterial artificial chromosome (BAC)でなくTnmdの発現制御領域を含むトランスジーンを構築する必要がある。現在、Tnmdの遺伝子発現パターンを反映するTnmdゲノム領域の範囲の検討を行っている。2015年度の4月より、若手研究(B)に本研究の内容を含む課題、「ゲノム編集技術を用いた歯根及び頭蓋の疾患モデルの作成と解析」が採択され、引き続き研究を継続している。

当引入病毒载体在体细胞中表达重编程基因时，所产生的 iPS 细胞的基因组中会发生突变。因此，我们选择了不插入引入细胞基因组中的附加型载体作为表达重编程基因的载体。由于还没有使用附加型载体建立小鼠 iPS 细胞系的报道，我们研究了有效建立的条件。从不同发育阶段（胚胎第12至14天）的小鼠胎儿中进行细胞分离，并确定了在14.5天时从胚胎中分离具有高活力和增殖能力的MEF的最佳条件。接下来，通过电穿孔将含有OCT3/4、SOX2、KLF-4、c-MYC、LIN28、NANOG和EBNA1以及p53的shRNA的四种附加型载体插入来自ScxGFP小鼠的MEF中。在补充有15％血清的ES细胞培养基中培养4周而无需传代，结果获得多个表现出iPS细胞样形态的集落。此外，使用TnmdCre敲入小鼠和报告小鼠进行报告基因表达分析的结果发现，插入基因组中的转基因的1个拷贝不足以检测Tnmd表达区域中的番茄。因此，要创建TnmdTomato小鼠，有必要构建含有Tnmd表达控制区的转基因，而不是细菌人工染色体（BAC）。我们目前正在研究反映 Tnmd 基因表达模式的 Tnmd 基因组区域范围。从2015年4月起，本研究内容“利用基因组编辑技术创建和分析牙根和颅骨疾病模型”的课题被选为青年研究员（B），研究仍在继续。

项目成果

Sox9- and Scleraxis-Cre Lingeage Fate Mapping in Aortic and Mitral Valve Structures.

主动脉瓣和二尖瓣结构中的 Sox9- 和 Scleraxis-Cre Lingeage 命运图谱。

• DOI: 10.3390/jcdd1020163
• 发表时间: 2014
• 期刊: J. Cardiovasc. Dev. Dis.
• 作者: Austin B;Yoshimoto Y;Shukunami C;Lincoln J.
• 通讯作者: Lincoln J.

軟骨と腱/靭帯の連結部の構築におけるScx+/Sox9+前駆細胞の役割

Scx+/Sox9+ 祖细胞在构建软骨和肌腱/韧带连接中的作用

• 发表时间: 2014
• 作者: Miki H;Minakuchi H;Ueda M;Shigemoto S;Suzuki Y;Maekawa K;Matsuka Y;Kuboki T.;高畠 清文;吉本由紀
• 通讯作者: 吉本由紀

歯周靭帯形成を解析するためのin vivoモデルの構築

构建分析牙周膜形成的体内模型

• 发表时间: 2014
• 作者: Takimoto A.;Kawatsu M.;Yoshimoto Y.;Kawamoto T.;Seiryu M.;Takano-Yamamoto T.;Hiraki Y.;Shukunami C.;宿南 知佐;吉本由紀，宿南知佐
• 通讯作者: 吉本由紀，宿南知佐