ターゲットキャプチャ―法によるウイルス同定法の開発と病原体サーベイランスへの活用

目标捕获法病毒识别方法的开发及其在病原监测中的应用

• 批准号: 22K21164
• 负责人: 久場 由真仁
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K21164/
• 关键词: 臨床検体; ウイルス同定; 次世代シーケンサー; ターゲットキャプチャ―法; ロングリードシークエンス; 次世代シークエンス; ターゲットキャプチャ; 病原体サーベイランス

本研究では、標的遺伝子に効率よくハイブリダイズし変異許容性の高いロングリードシークエンス（LRS）用のプローブ作製およびNanoporeシーケンサーに最適なライブラリ作製の条件検討を行い、臨床検体を用いた評価を行うことで、LRSを用いたターゲットキャプチャ―法による高感度かつ迅速な病原体同定法の開発および病原体サーベイランスへの活用を目指すことを目的としている。ショートリードシークエンス（SRS）を用いたターゲットキャプチャ法では標的遺伝子全長をカバーできるように約100bpの複数プローブを部分的に重ね合わせて設計するが、LRSをベースとした最適なプローブ条件は不明である。より高効率な結果取得のためには、LRSに最適なプローブ設計（プローブ長、標的遺伝子とプローブの重なり合う割合、投入プローブ数等）やライブラリ調製法の条件検討が必要である。2022年度は、SARS-CoV-2ゲノムに対して効率良くハイブリダイズし変異許容性の高いプローブの作製を検討した。具体的には、リファレンス株をベースに①1kbおよび2kb間隔ごとに設計したプローブ、②5'末端のnsp2遺伝子領域のみを標的に設計したプローブ、③ゲノム中央のnsp12領域のみを標的に設計したプローブ、④3'末端のN領域のみを標的に設計したプローブの4種類を作製した。また、変異許容性を確認するため、リファレンス株と主要変異株を含むマルチアライメントをベースに1kbおよび2kb間隔ごとに設計したプローブも作製した。

在这项研究中，我们将创建能够与目标基因高效杂交并具有高突变耐受性的长读长测序（LRS）探针，检查纳米孔测序仪的最佳文库创建条件，并使用临床样本进行评估，目的是开发一种高度可检测的探针。一种使用 LRS 目标捕获方法的灵敏而快速的病原体识别方法，并将其用于病原体监测。在使用短读长测序（SRS）的目标捕获方法中，大约100 bp的多个探针被设计为部分重叠以覆盖目标基因的整个长度，但基于LRS的最佳探针条件尚不清楚。为了获得更高效的结果，需要考虑LRS的最佳探针设计（探针长度、目标基因与探针之间的重叠率、输入探针的数量等）和文库制备方法条件。 2022 财年，我们研究了与 SARS-CoV-2 基因组有效杂交并具有高突变耐受性的探针的创建。具体来说，①根据参考菌株以1kb和2kb间隔设计的探针，②仅针对5'端的nsp2基因区域设计的探针，③仅针对基因组中心的nsp12区域设计的探针，④3我们创建了四种类型的探针，旨在仅针对末端 N 区域。此外，为了确认突变耐受性，我们还基于包括参考菌株和主要突变菌株的多重比对，以1kb和2kb间隔设计了探针。