Electron microscopic analysis of macular hole after stem cell-derived retinal organoid transplantation

干细胞源性视网膜类器官移植后黄斑裂孔的电镜分析

• 批准号: 22K20968
• 负责人: 秋葉 龍太朗
• 金额: $ 1.33万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20968/
• 关键词: 黄斑円孔; 網膜再生; ES細胞; 電子顕微鏡; シナプス; 幹細胞

黄斑円孔は網膜中心部が障害され視力低下をきたす疾患であり、手術によって治療困難な症例が問題となっている。今回の研究で我々はニホンザルの黄斑円孔モデルに対し、ヒトES細胞由来の網膜組織を移植し、円孔閉鎖が可能であるかを検討する。さらに移植後の網膜組織をSerial Blockface Scanning Electron Microscopy (SBFSEM)で撮影し、得られた画像から網膜の神経細胞を三次元再構築およびシナプス解析を行うことで、移植した細胞とホストの網膜がシナプス形成を行い、網膜回路の修復が可能であるかを検討する。研究計画１年目の時点では、共同研究先である神戸アイセンター研究所においてヒトES細胞から分化誘導した網膜組織を作成した。さらに、全身麻酔下の硝子体手術でES細胞由来網膜組織をニホンザルの黄斑円孔眼の黄斑円孔中心部に移植することに成功した。そして移植後半年の時点まで、継続して網膜組織が生着し、黄斑円孔が閉鎖していることを光干渉断層計(OCT)を用いて非侵襲的に確認することに成功した。移植半年後に全身麻酔下で眼球摘出および網膜サンプルの固定を行った。移植後の網膜組織はUniversity of Washingtonに送付し、電子顕微鏡撮影のためのオスミウム染色や脱水、レジンブロック包埋などの前処理を行った上、厚切り切片の光学顕微鏡像を用いて撮影部位を決定し、移植片とホスト網膜黄斑円孔境界部にしぼったサンプルのトリミングを行い、SBFSEM画像撮影に成功した。今後は撮影後の画像を千葉大学において解析する予定である。

黄斑裂孔是一种损害视网膜中央部分、导致视力下降的疾病，手术难以治疗的情况已成为一个问题。在这项研究中，我们将把人类ES细胞来源的视网膜组织移植到日本猕猴的黄斑裂孔模型中，并检查是否有可能闭合该裂孔。此外，通过使用串行块面扫描电子显微镜（SBFSEM）拍摄移植后的视网膜组织，并根据获得的图像对视网膜神经元进行三维重建和突触分析，可以在移植细胞和宿主视网膜之间建立突触我们将研究是否可以修复视网膜回路。在该研究项目的第一年，联合研究伙伴神户眼科中心研究所通过分化诱导的人类 ES 细胞创建了视网膜组织。此外，我们在全身麻醉下通过玻璃体切除术成功地将ES细胞来源的视网膜组织移植到日本猕猴黄斑洞眼的黄斑洞中心。使用光学相干断层扫描（OCT），他们成功地以非侵入性方式确认视网膜组织继续移植，并且黄斑裂孔在移植后六个月内已经闭合。移植后六个月，眼球被摘除，视网膜样本在全身麻醉下固定。移植后的视网膜组织被送往华盛顿大学，进行锇染色、脱水、树脂块包埋等预处理，进行电镜成像，确定样本位于移植物与宿主视网膜黄斑的交界处。孔，修整样品，成功拍摄SBFSEM图像。未来，这些图像将在千叶大学进行分析。