膵液糖タンパク質GP2のN型糖鎖と細菌レクチンFimHとの構造-親和性相関

胰液糖蛋白GP2 N-聚糖与细菌凝集素FimH之间的结构亲和关系

基本信息

批准号：
22K20563
负责人：
西尾俊亮
金额：
$ 1.83万
依托单位：
Fukushima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

腸管は、私達が摂取した食べ物や侵入してきたウイルスや病原菌、さらに約100兆個にもなる腸内細菌に常に曝されている。多数の腸内細菌が生息している大腸は、厚い2層のムチン層による粘膜バリアをもち、腸管の恒常性を維持している。しかし、栄養不良などによる粘膜バリアの菲薄化は、腸内細菌の腸上皮細胞表面への定着を引き起こし、炎症性腸疾患の原因となりうる。GP2は、大腸が持つ炎症を抑制的に制御する仕組みの一つである。GP2は膵臓で合成される糖タンパク質で、腸管管腔へ移行したのち腸内細菌の線毛タンパク質FimHに結合し定着を阻害する。本研究では、腸管管腔における細菌認識機構について、GP2とFimHとの結合におけるタンパク質および糖鎖レベルでの構造活性相関を明らかにする。研究計画初年度となる今年度は、マウスGP2のFimH結合ドメイン（D10Cドメイン）を哺乳類細胞で発現・精製するためのコンストラクトを構築した。発現コンストラクトをHEK293T細胞に導入し、培養上清への分泌を確認した。さらに、N結合型糖鎖付加部位に変異を導入したコンストラクトを作製し、同様に発現・分泌を確認した。分泌した組換えGP2タンパク質を部分精製し、糖鎖切断酵素による糖鎖構造の解析を行った。その結果、組換えGP2にはFimHが認識すると予想される構造の糖鎖がほとんどないことが明らかになった。また、大腸菌FimHのGP2結合レクチンドメインを発現するためのコンストラクトを構築し、大腸菌への形質転換後、ペリプラズムへの分泌発現を確認した。組換えFimHタンパク質を部分精製し、バイレイヤー干渉法（BLI）による糖タンパク質との相互作用解析系を立ち上げた。

肠道不断暴露于我们摄入的食物，已入侵的病毒和病原体以及大约100万亿肠细菌。大肠的许多肠道细菌所在，具有由两个厚的粘蛋白层组成的粘膜屏障，可维持肠稳态。然而，由于营养不良或类似的粘膜屏障的变化会导致肠道细菌在肠上皮细胞表面定殖，并可能引起炎症性肠病。 GP2是抑制大肠所具有的炎症的机制之一。 GP2是在胰腺中合成的糖蛋白，在它迁移到肠腔后，它与肠道细菌的pili蛋白FIMH结合并抑制定殖。这项研究揭示了GP2与FIMH结合的蛋白质和聚糖水平的结构活性关系，以实现肠腔中的细菌识别机制。今年是研究项目的第一年，我们为哺乳动物细胞中小鼠GP2的FIMH结合结构域（D10C结构域）的表达和纯化构建。将表达构建体引入HEK293T细胞中，并确认为培养物上清液的分泌。此外，准备了一种突变引入N连接的聚糖添加位点的构造，并以相同的方式确认表达和分泌。分泌的重组GP2蛋白被部分纯化，并使用糖基化酶分析糖基化结构。结果表明，重组GP2几乎没有FIMH预测识别的结构的聚糖。此外，构建了一个构建体以表达大肠杆菌FIMH的GP2结合凝集素结构域，并在转化为大肠杆菌后，确认了分泌到pariplasm的表达。重组FIMH蛋白被部分纯化，并通过双层干涉法（BLI）分析与糖蛋白相互作用的系统。