Structural and functional analysis of diverse RNA helicases involved in innate immunity

参与先天免疫的多种 RNA 解旋酶的结构和功能分析

• 批准号: 22H00403
• 负责人: 西増 弘志
• 金额: $ 27.46万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H00403/
• 关键词: RNA; 免疫; RNAヘリカーゼ; クライオ電子顕微鏡; helicase; innate immunity

RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。LGP2によるMDA5:RNAフィラメント形成の促進機構を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を用いてLGP2:MDA5:RNA複合体構造の決定を目指す。本年度は、研究の遂行に必要なタンパク質、RNAの調製を行い、RNAフィラメント形成条件の予備的検討を行った。先行研究を参考に、MDA5はHis×6-SUMOタグを付加した組換えタンパク質として大腸菌において大量発現させ、NiNTAカラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した。LGP2はバキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いて発現させ、カラムクロマトグラフィーを用いて同様に精製した。長鎖dsRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro 転写により大量合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。これらの精製したMDA5、LGP2、dsRNAを混合することにより、LGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体が調製できることを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。このLGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体をグリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡TalosArcticaを用いてデータ測定を行い、予備的な電子顕微鏡画像データを取得した。

RNA解旋酶利用ATP水解改变其三级结构，并以ATP依赖性方式与双链RNA结合和解离。 RNA解旋酶分为多种类型，其中RIG-I样RNA解旋酶在免疫系统中发挥着重要作用。在本研究项目中，我们将利用冷冻电子显微镜和高速原子力显微镜进行静态和动态三维结构分析，以阐明RIG-I样RNA解旋酶的各种操作机制。为了阐明LGP2促进MDA5:RNA丝形成的机制，我们的目标是利用冷冻电子显微镜单颗粒分析确定LGP2:MDA5:RNA复合物的结构。今年，我们准备了研究所需的蛋白质和RNA，并对RNA丝的形成条件进行了初步研究。参考之前的研究，MDA5作为带有His×6-SUMO标签的重组蛋白在大肠杆菌中大量表达，并使用NiNTA柱、肝素柱和凝胶过滤柱纯化至高纯度。使用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达LGP2，并使用柱层析类似地纯化。使用 T7 RNA 聚合酶通过体外转录大量合成长链 dsRNA，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，通过混合这些纯化的MDA5、LGP2和dsRNA可以制备LGP2:MDA5:dsRNA异丝复合物。将这种 LGP2:MDA5:dsRNA 异丝复合物快速冷冻在网格上，并使用冷冻电子显微镜 TalosArctica 测量数据，以获得初步的电子显微镜图像数据。