DNAメチル化がTDP-43の自己調節に与える影響に着目したALS病態の解明

阐明 ALS 病理学，重点关注 DNA 甲基化对 TDP-43 自身调节的影响

• 批准号: 19K23961
• 负责人: 小池 佑佳
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-02-26 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K23961/
• 关键词: 筋萎縮性側索硬化症; TDP-43; DNAメチル化; スプライシング; 自己調節機構; 選択的スプライシング; 加齢; TARDBP

私は，TARDBP 3’UTR のDNAメチル化状態が選択的スプライシング機構を介し，TARDBPの発現量を規定するのではないかと推測した．まずはゲノム編集の手法により，HEK293T細胞のTARDBP 3 'UTR にあるCpG部位を特異的に脱メチル化させ，TARDBPの選択的スプライシング効率とmRNA発現量を評価した．次に，非中枢神経疾患患者 8例由来の凍結剖検脳組織 (運動野皮質，後頭葉皮質および小脳半球) を用いて，TARDBP 3 'UTR のCpG部位のメチル化状態を解析した．さらに，運動野皮質において，TARDBP 3’UTRのDNAメチル化率と選択的スプライシング効率の関連を検討した．TARDBP 3’UTRの15か所のCpG部位を標的特異的に脱メチル化させた細胞では，コントロール細胞と比べ，TARDBP pre-mRNAの選択的スプライシング効率が減弱し，TARDBP mRNA 発現量は約2倍に増加した．剖検脳組織の解析では，TARDBP 3'UTRのDNAメチル化率は，脳領域に依存して異なっていた．運動野皮質では，これらのCpG部位のDNAメチル化率は，年齢とともに減少していた．さらに，運動野皮質において，TARDBP 3'UTRの一部のCpG部位のDNAメチル化率は選択的スプライシング効率と有意に正の相関を示した．これまでの研究において，TARDBP 3'UTRのDNAメチル化状態が，TARDBP mRNAの発現量を規定することを示した．また，健常脳組織の解析から，TARDBP 3'UTRのDNAメチル化状態は，脳領域や加齢による影響を受けやすいことが示唆された．ALS病態におけるエピジェネティクスの寄与を明らかにするため，研究再開後は，孤発性ALS患者脳を用いて，TARDBP 3’UTRのDNAメチル化状態が変容しているか，調べる予定である．

我推测TARDBP 3'UTR的DNA甲基化状态可能通过选择性剪接机制调节TARDBP的表达水平。首先，我们利用基因组编辑技术对HEK293T细胞TARDBP 3'UTR中的CpG位点进行特异性去甲基化，并评估TARDBP选择性剪接效率和mRNA表达水平。接下来，我们使用来自 8 名非中枢神经系统疾病患者的冷冻尸检脑组织（运动皮层、枕叶皮层和小脑半球）分析了 TARDBP 3' UTR 的 CpG 位点的甲基化状态。此外，我们研究了 TARDBP 3'UTR DNA 甲基化率与运动皮层选择性剪接效率之间的关系。在TARDBP 3'UTR中的15个CpG位点被靶特异性去甲基化的细胞中，与对照细胞相比，TARDBP前体mRNA选择性剪接效率减弱，并且TARDBP mRNA表达水平大约增加一倍。尸检脑组织分析表明，TARDBP 3'UTR 的 DNA 甲基化率根据脑区域的不同而不同。在运动皮层中，这些 CpG 位点的 DNA 甲基化率随着年龄的增长而降低。此外，在运动皮层中，TARDBP 3'UTR中一些CpG位点的DNA甲基化率与可变剪接效率呈显着正相关。前期研究表明，TARDBP 3'UTR的DNA甲基化状态决定了TARDBP mRNA的表达水平。此外，对健康脑组织的分析表明，TARDBP 3'UTR的DNA甲基化状态很容易受到脑区域和衰老的影响。为了阐明表观遗传学对ALS病理学的贡献，我们计划利用散发性ALS患者大脑来检查恢复研究后TARDBP 3'UTR的DNA甲基化状态是否发生改变。

项目成果

小池 佑佳，加藤 泰介，廣川 祥子，小林 憲太，辻 省次，小野寺 理

小池佑香、加藤大辅、广川翔子、小林健太、辻庄二、小野寺修

• 发表时间: 2019
• 作者: Yuka Koike;Akihiro Sugai;Akio Yokoseki;Tomohiko Ishihara;Norikazu Hara;Junko Ito;Takeshi Ikeuchi;Akiyoshi Kakita;Osamu Onodera;Therapeutic strategy based on genome editing for dentatorubral-pallidoluysian atrophy.;歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症モデルマウスに対するゲノム編集効果
• 通讯作者: 歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症モデルマウスに対するゲノム編集効果

Yuka Koike，Taisuke Kato，Sachiko Hirokawa，Kenta Kobayashi，shoji Tsuji, Osamu Onodera

小池佑香、加藤大辅、广川幸子、小林健太、辻庄司、小野寺修

• 发表时间: 2019
• 作者: Yuka Koike;Akihiro Sugai;Akio Yokoseki;Tomohiko Ishihara;Norikazu Hara;Junko Ito;Takeshi Ikeuchi;Akiyoshi Kakita;Osamu Onodera;Therapeutic strategy based on genome editing for dentatorubral-pallidoluysian atrophy.
• 通讯作者: Therapeutic strategy based on genome editing for dentatorubral-pallidoluysian atrophy.

Alteration of TDP-43 autoregulation-relevant splicing by DNA methylation status of TARDBP DNA

TARDBP DNA 的 DNA 甲基化状态改变 TDP-43 自身调节相关剪接

• 发表时间: 2019
• 作者: Yuka Koike;Akihiro Sugai;Akio Yokoseki;Tomohiko Ishihara;Norikazu Hara;Junko Ito;Takeshi Ikeuchi;Akiyoshi Kakita;Osamu Onodera
• 通讯作者: Osamu Onodera