低温適応酵素における低温適応機構の分子メカニズムの解明

阐明冷适应酶的冷适应分子机制

基本信息

批准号：
17H06955
负责人：
堀谷正樹
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Saga University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-08-25 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H06955/
关键词：
生体関連化学生物物理低温酵素生物無機化学酵素生体分子

项目摘要

①低温細菌Shewanella sp. AS-11 由来の無機ピロフォスファターゼ（Sh-PPase）を大腸菌にて過剰発現し、精製を行った。Sh-PPaseは活性中心に2つのマンガンイオンを有するが、精製試料は金属結合体で無かったため、過剰量のMnイオンを含む緩衝液で活性化処理を行いEPR測定を行った。ところが、フリーのMnイオン由来のEPR信号に邪魔されて酵素由来の信号の解析が困難であった。そこで金属イオン活性化条件の再検討を行い、フリーのMnイオンを除去し、不純物のない活性型Sh-PPaseを精製することに成功した。この試料を用いて種々の条件でのEPR測定を行い、電子状態の解析を行った。解析結果より、2つのマンガンイオン間の距離が3.55Aであり、これまで明らかになっている2つのマンガンイオンを有する酵素と比較して非常に小さな磁気相互作用を持っていることを明らかにした。今後はこの活性化法を用いて、基質結合型での活性中心近傍の構造解析、さらに基質結合型、非結合型における活性中心の構造と酵素活性の温度依存性を明らかにしていく。②上記低温菌由来酵素との比較対象として、新たに中温菌由来無機ピロフォスファターゼの遺伝子を組み込んだプラスミドを作製した。またこれを用いて大腸菌での発現系の構築にも成功した。今後精製系をさらに精査し、低温菌由来酵素との比較実験を行う予定である。③Sh-PPaseの構造変化の温度依存性を直接観測するための変異体作製の設計を行った。今後数種類の変異体の発現・精製を行う予定である。④これまで開発してきた高速混合凍結装置について、さらに再現性良く試料の作製を行うため、ミキサー部の改良を行った。これを用いて現在試料のクエンチ時間の再構成実験を行っている。

1）源自低温细菌Shewanella sp。 AS-11在大肠杆菌中过表达并纯化。 SH-PPase在其活性中心具有两个锰离子，但是纯化的样品不是金属偶联物，因此通过用含有过量Mn离子的缓冲液激活EPR。但是，它受到了自由Mn离子衍生的EPR信号的阻碍，这使得很难分析酶衍生的信号。因此，重新检查金属离子激活条件，并去除游离MN离子，并纯化无杂质的活性SH-PPase。该样品用于在各种条件下测量EPR并分析电子状态。分析结果表明，两个锰离子之间的距离为3.55a，与迄今为止揭示的两个锰离子相比，磁相互作用非常小。将来，我们将使用这种激活方法分析底物结合中活性中心的结构以及在底物结合和非结合类型中活性中心和酶活性的温度依赖性。 2）制备了一种新的质粒，该质粒结合了源自中等细菌的无机焦磷酸酶的基因，作为与源自冷冻保护剂的酶的比较。使用它，我们还成功地在大肠杆菌中构建了表达系统。将进一步检查纯化系统，并将使用源自冷冻细菌物种的酶进行比较实验。 ③我们设计了突变产生，以直接观察SH-PPase结构变化的温度依赖性。计划将来表达和纯化几种类型的突变体。 ④改进了混音器部分，以确保直到现在开发的高速混合和冷冻设备可以进一步重现以制备样品。这用于在样品的淬火时间进行重建实验。