Structural and mechanistic study of C-N bond forming cytochrome P450 enzyme

C-N键形成细胞色素P450酶的结构和机制研究

基本信息

批准号：
17H06579
负责人：
中村仁美
金额：
$ 1.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-08-25 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H06579/
关键词：
酵素反応天然物結晶構造解析 enzyme mechanism biocatalysis

项目摘要

TleBは放線菌由来の天然物テレオシジンの生合成酵素である。TleBは直接酸化型C-N結合形成反応を触媒する珍しいシトクロムP450酵素であり、生体触媒としての応用が期待される。TleBの反応機構を調べるため、野生型酵素の X線結晶を入手し、その情報をもとに活性中心のアミノ酸残基に変異を導入した変異体酵素を作成した。野生型酵素と変異体酵素の活性を比較し、触媒活性に必須のアミノ酸残基を同定した。同時に、TleBの反応中間体を捉えるため、C-N結合を形成する窒素を酸素、または硫黄に置換した非天然型気質をデザイン,合成した。非天然型基質とTleB酵素の共結晶構造解析から、非天然型基質はTleBの活性中心で天然基質と同様な相互作用を持つことを確認した。この結果から、非天然型基質の反応機構は、天然型の反応機構に関連があることが示唆された。非天然型気質を用いた酵素反応から反応産物を単離し、構造決定を行った。窒素を酸素に置換した非天然型基質から得られた酵素反応産物は三環式構造を有し、エポキシド中間体を介したメカニズムで形成されると考察した。更に、窒素を硫黄に置換した非天然型基質を用いた反応では、C-S結合が形成されることを確認した。本研究により、TleBは様々な気質を受け入れること、また基質の構造により、元来とは異なる結合を作成できることを証明した。本研究で得られた非天然型反応産物はどれも新規化合物であり、現在これらの生物活性を調べている。また、TleBの基質許容性を把握するため、その他の基質も合成している。

TleB 是一种源自放线菌的天然产物 teleosidin 的生物合成酶。 TleB是一种罕见的细胞色素P450酶，可催化直接氧化C-N键形成反应，有望用作生物催化剂。为了研究 TleB 的反应机制，他们获得了野生型酶的 X 射线晶体，并利用该信息创建了突变酶，其中在活性中心的氨基酸残基中引入了突变。比较野生型酶和突变型酶的活性，并鉴定催化活性必需的氨基酸残基。同时，为了捕获TleB的反应中间体，我们设计并合成了一种非天然气，其中形成C-N键的氮被氧或硫取代。非天然底物和TleB酶的共晶结构分析证实非天然底物与TleB活性中心的天然底物具有相似的相互作用。该结果表明非天然底物的反应机理与天然类型的反应机理有关。使用非天然酶从酶促反应中分离出反应产物，并确定了它们的结构。我们认为，从氮被氧取代的非天然底物获得的酶促反应产物具有三环结构，并且是通过环氧化物中间体介导的机制形成的。此外，我们证实，在使用非天然底物的反应中形成了 C-S 键，其中氮被硫取代。这项研究表明，TleB 可以接受不同的气质，并且可以根据基材的结构形成不同的键。本研究获得的所有非天然反应产物均为新化合物，其生物活性目前正在研究中。此外，正在合成其他底物以了解 TleB 的底物耐受性。