無血清培養系での口腔癌患者由来活性化リンパ球からのiPS細胞の樹立とその治療応用

无血清培养系统中口腔癌患者活化淋巴细胞的 iPS 细胞的建立及其治疗应用

基本信息

批准号：
16H07003
负责人：
赤木恵理
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-08-26 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件で誘導したヒトiPS細胞(hiPSC)を細胞傷害活性の高いリンパ球に再分化させ大量培養し、口腔癌の免疫細胞治療へ応用することを目的としている。本年度は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件での末梢血単核球(PBMC)由来hiPSCの誘導法の効率化を検討した。口腔癌患者から採取したPBMCを、IL-2を添加した無血清培地RD5F(当研究室で開発)にて初代培養を行い増殖した活性化リンパ球にインテグレーションフリーのセンダイウイルスベクターSeVdpを用いて初期化4遺伝子を導入し、無血清培地hESF9(当研究室で開発)を用いてlaminin-E8上に播種しPBMC由来hiPSCを樹立した。更に効率よくhiPSCを誘導するために条件検討を行った。①分離したPBMCを0、3、6日の各日数で初代培養しSeVdpに感染させた。②SeVdp感染時のMOIを3、6、9の各種濃度とした。③SeVdp感染後の細胞を100000、200000、500000 cells/wellの各密度で6wellプレート1wellに播種した。これらの条件検討から、PBMCを6日間初代培養し、SeVdpをMOI6で感染させ、100000 cells/wellの密度で播種した条件が最も効率良くhiPSCを誘導できることが示された。さらに誘導されたPBMC由来hiPSCの未分化性の評価をRT-PCR法および蛍光免疫染色法にて検討した。誘導されたhiPSCは未分化マーカー遺伝子および蛋白発現を示した。また三胚葉への分化多能性をin vitroでは胚様体培養法を用い、in vivoではSCID mouseでのテラトーマ形成能を用いて評価したところ、いずれにおいても三胚葉への分化能を有していた。

这项研究旨在重新分化在无整合，无饲料，无血清培养条件下诱导的人IPS细胞（HIPSC），并将其应用于具有高细胞毒性活性的淋巴细胞，并将其应用于口腔癌的免疫细胞治疗中。今年，我们研究了外周血单核细胞（PBMC）衍生的HIPSC的诱导方法的效率。从口腔癌患者中收集的PBMC在无血清培养基RD5F（在我们的实验室中开发）中均培养，并补充了IL-2，并将4个基因引入活化的淋巴细胞中，并使用无集成的sendai病毒病毒载体SEVDP，然后使用lamimin-e8 provirative sevection sevdp，然后使用laminin-e8（在laminin-emfore中）（我们使用laminin-e8）（在我们的hiss中建立）（我们在我们的hesf9中） PBMC。检查条件以进一步有效诱导hipscs。 1）将分离的PBMC培养为0、3和6天，并用SEVDP感染。 ②将SEVDP感染时的MOI设置为各种浓度的3、6和9。SeVDP感染后的细胞，将100,000、200,000和500,000个细胞/孔密度的6个井板中的1孔接种。这些条件表明，当PBMC培养6天，用MOI6感染SEVDP并以100,000个细胞/孔的密度接种时，HIPSC最有效地诱导了HIPSC。此外，通过RT-PCR和荧光免疫染色研究了对诱导PBMC衍生的HIPSC的未分化的评估。诱导的HIPSC显示出未分化的标记基因和蛋白质表达。此外，当使用胚胎体培养方法和在体内使用畸胎瘤形成能力在体外评估将triderm的多能量化在SCID小鼠中的体外评估时，发现在所有情况下，它在Triderm中都有分化为Triderm。