KLF4DNA結合部位アミノ酸残基の機能解析から改良リプログラミング因子の開発

通过 KLF4 DNA 结合位点氨基酸残基的功能分析开发改进的重编程因子

• 批准号: 16H06662
• 负责人: 林 洋平
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-08-26 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16H06662/
• 关键词: iPS細胞; リプログラミング; 転写因子; タンパク質構造; KLF4; タンパク質工学; 発現制御; 細胞・組織; バイオテクノロジー; 蛋白質; 再生医学

本研究はiPS細胞へリプログラミングするのに利用されているKLF4タンパク質について、DNAと直接相互作用することが見出されたアミノ酸残基の機能解析を実施し、リプログラミング能に必須なアミノ酸残基を同定し、KLF4タンパク質の構造と機能の知見から、野生型タンパク質よりも優れたリプログラミング能を持つ「人工リプログラミング因子」の開発を目指した。予備検討で見出したKLF4ジンクフィンガードメイン（ZFD）内でDNAと相互作用するアミノ酸残基一つ一つの重要性を評価するために、アミノ酸残基の機能を打ち消したアラニン置換変異体を作製した。これらの変異体コンストラクトにはN末端に3xFLAGタグを融合しておき、以下の実験を行った。1. 哺乳類細胞内のタンパク質発現量と寿命の測定：野生型、変異型それぞれのKLF4を遺伝子導入した哺乳類細胞をシクロへキシミド処理によってタンパク質翻訳を停止させた。その後、異なった時間に細胞からタンパク質を回収し、FLAGタグに対するWestern Blottingによって各KLF4変異体のタンパク量を測定した。2. iPS細胞へのリプログラミング能の測定：それぞれの野生型、変異型KLF4を他のリプログラミング因子（OCT4, SOX2, MYC)と共にマウス胎児繊維芽細胞（Nanog-GFP MEF)に遺伝子導入し、iPS細胞作製を試みた。作製されたNanog-GFP陽性コロニーの数を数日ごとに計測し、リプログラミングの効率と速さをそれぞれ解析した。以上から総合的に判断して、どのアミノ酸残基がKLF4の分子基盤として重要なのかを評価した。さらに、野生型より強いリプログラミング能を持つ変異型を探索した。

这项研究对氨基酸残基进行了功能分析，该氨基酸残基与DNA直接相互作用用于重新编程的KLF4蛋白，并确定了对重编程能力必不可少的氨基酸残基，并基于对KLF4蛋白的结构和功能的了解，我们旨在发展具有较高重编程能力的人工重编程因子相比野生蛋白质蛋白质较高的蛋白质。为了评估在初步研究中发现的每个氨基酸残基与KLF4锌指域（ZFD）中与DNA相互作用的重要性，创建了丙氨酸取代突变体，以取消氨基酸残基的功能。这些突变体构建体在N末端与3XFLAG标签融合，并进行了以下实验。 1。哺乳动物细胞中蛋白质表达和寿命的测量：蛋白质翻译通过环己二酰亚胺处理用野生型和突变型KLF4转染的哺乳动物细胞来阻止。然后在不同时间从细胞中收集蛋白质，并通过蛋白质印迹对标记标签确定每个KLF4突变体的蛋白质水平。 2。对IPS细胞的重编程能力的测量：每个野生型，突变的KLF4都用其他重编程因子（OCT4，SOX2，MYC）转染到小鼠胚胎成纤维细胞（Nanog-GFP MEF）中，并尝试了IPS细胞的产生。每隔几天测量制备的Nanog-GFP阳性菌落的数量，分别分析了重编程的效率和速度。基于上述，我们评估了哪些氨基酸残基作为KLF4的分子基础很重要。此外，我们搜索了比野生型具有更强重编程功能的突变形式。

项目成果

BMP-SMAD-ID promotes reprogramming to pluripotency by inhibiting p16/INK4A-dependent senescence

• DOI: 10.1073/pnas.1603668113
• 发表时间: 2016-11-15
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Hayashi, Yohei;Hsiao, Edward C.;Yamanaka, Shinya
• 通讯作者: Yamanaka, Shinya

Structure-based discovery of NANOG variant with enhanced properties to promote self-renewal and reprogramming of pluripotent stem cells

• DOI: 10.1073/pnas.1502855112
• 发表时间: 2015-04-14
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Hayashi, Yohei;Caboni, Laura;Fletterick, Robert J.
• 通讯作者: Fletterick, Robert J.