軸策誘導因子Netrin-1を標的にした新規髄芽細胞腫瘍治療法の開発

开发针对轴突诱导因子 Netrin-1 的新型髓母细胞瘤疗法

基本信息

批准号：
15H06457
负责人：
中山寛尚
金额：
$ 1万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-08-28 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H06457/
关键词：
軸索誘導因子 netrin-1 髄芽腫血管新生

项目摘要

小児脳腫瘍である髄芽腫（medulloblastoma, 以下MBとする）は、小脳に発症する悪性腫瘍である。私はこれまでに、MB腫瘍細胞自身から遊離される軸索誘導因子netrin-1がMB細胞の浸潤能の促進に関わっていることを見出し、さらにMB腫瘍バイオマーカーとしての有用性を提案してきた(Cancer Res, 2014)。本研究では、netrin-1シグナルを阻害することによるMB腫瘍抑制効果を、MBモデル動物を用いて評価する。平成27年度はnetrin-1とそのレセプターの機能を阻害するため、netrin-1レセプター阻害剤（環状ペプチド）の開発を目指す。我々はまず、環状ペプチドをRaPID (random nonstandard peptides integrated discovery, Chem Biol., 2011)システムでスクリーニングするため、netrin-1蛋白質の精製を試みた。Netrin-1はビーズに固定化するためHis x 10 tagをC末端に付加したコンストラクトを作成した。このプラスミドを293T細胞に導入して、培養液中に分泌されたnetrin-1-His10蛋白質を回収しニッケルカラムを用いて精製した。ペプチドスクリーニングには高い精製度が必要なため、現在はイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製を続けている。精製蛋白質の生理活性はnetrin-1レセプターであるneogeninを高発現した細胞を用いてERKシグナルを測定する予定である。neogenin発現細胞の作成はすでに完了している。次年度に予定しているMBモデルマウス(smo/smoマウス)はすでに購入し繁殖を開始しており、受精卵の保存が完了している。阻害ペプチドが完成次第、動物実験への移行が可能な状況である。

小脑肿瘤是小脑中发生的恶性肿瘤（MB，MB），是小脑中发生的恶性肿瘤。到目前为止，我发现从MB肿瘤细胞本身释放的轴引导因子Netrin-1参与促进MB细胞的浸润，并且还提出了其作为MB肿瘤生物标志物的有用性（癌症Res， 2014）。在这项研究中，使用MB模型动物评估Netrin-1信号通过抑制Netrin-1信号来抑制MB肿瘤。在2015财年，我们旨在开发Netrin-1受体抑制剂（环状肽）以抑制Netrin-1及其受体的功能。我们首先尝试改进Netrin-1蛋白，以筛选快速（随机非标准肽综合发现，Chem Biol。，2011）系统上的环状肽。 Netrin-1创建了一个用X 10标签添加到C端子中以固定珠子的构造。将该质粒引入293T细胞中，并使用镍柱回收并纯化培养物中分泌的Netrin-1-His10蛋白。由于肽清洁需要高度的纯化，因此目前使用离子交换色谱法连续进行精制。计划使用高表达细胞Neogin蛋白（Netrin-1受体）测量精制蛋白的生理活性。新生素表达细胞的创建已经完成。安排在下一个财政年度的MB型鼠标（SMO/SMO鼠标）已经被购买并开始繁殖，并且已经完成了受精卵的保存。一旦抑制肽完成，就可以转移到动物实验。